揭秘摩洛哥森林根瘤菌 Bradyrhizobium sp. RDM4 的基因组奥秘，探索生态修复新契机

为探究与摩洛哥特有灌木共生的固氮细菌，研究人员开展了对 Bradyrhizobium sp. RDM4 的基因组研究。他们获得其 8.4 Mb 草图基因组，含 8141 个基因，7032 个蛋白质编码基因。这有助于理解共生固氮机制，推动生态修复研究。

　　Fabaceae 植物能与土壤中的根瘤菌（rhizobia）建立共生关系，这对土壤肥力意义重大。Retama dasycarpa 是摩洛哥高阿特拉斯山脉特有的豆科植物，这种灌木对极端环境适应良好，在退化生态系统恢复方面发挥着积极作用。

Bradyrhizobium sp. RDM4 菌株分离自生长在摩洛哥马莫拉森林土壤中的 R. dasycarpa 根瘤。研究人员先将根瘤用 0.1% 氯化汞溶液表面消毒 1 分钟，接着在 50 微升无菌蒸馏水中碾碎。把得到的悬浮液涂抹在酵母提取物甘露醇（Yeast-Extract-Mannitol，YEM）琼脂培养基上，在 28°C 的环境下培养 7 到 15 天。挑取长出的菌落，在固体 YEM 培养基上多次划线分离，直至得到纯培养物，并将其保存在 4°C 环境中。

从在 5 毫升液体 TY 培养基中、28°C 培养 5 天的新鲜细菌培养物里，研究人员利用 PureLink 基因组 DNA 小提试剂盒（Invitrogen）提取基因组 DNA，再用赛默飞世尔科技（Thermo-Scientific）的 NanoDrop 2000 分光光度计进行定量。该培养物源自从固体 YEM 培养基上挑取的一个纯菌落。

研究人员按照测序 gDNA 条形码试剂盒（Sequencing gDNA Barcoding Kit，SQK - RBK004）的制造商建议，使用 400 纳克高分子量 DNA 制备文库。依据制造商的操作说明，在配备 FLO - MIN106D、R.9.4.1 流动池的 GridION 设备上进行 72 小时的 DNA 测序（牛津纳米孔技术公司，英国）。使用集成在 MinKNOW（v5.9.18）中的 Dorado 软件（v7.3.11）里的高精度（High Accuracy，HAC）模型进行碱基识别。

利用 FastQC 1.2.1 版本对原始读数进行质量检测，用 Porechop 0.2.4 版本进行接头修剪，再通过 NanoFilt 2.8.0 版本进行过滤。使用 Canu 2.2 版本进行基因组从头（De novo）组装，用 Racon 1.5.0 版本抛光 4 次，用 Medaka 2.0.1 版本抛光 1 次。测序共产生 16642 条读数，N₅₀值为 16731 碱基对。使用 Quast 5.2.0 版本评估组装质量，借助 NCBI 原核基因组注释管道进行基因组注释。通过类型菌株基因组服务器确定与测序基因组最相近的模式菌株，利用基因组间距离计算器（Genome - to - Genome Distance Calculator，GGDC v. 3.0）的公式 4 计算数字 DNA - DNA 杂交（digital DNA - DNA hybridization，dDDH）值，用 pyani 0.3.0 - alpha 版本确定平均核苷酸同一性（average nucleotide identity，ANI）。除特殊说明外，所有软件均使用默认参数。

从头组装得到 2 个重叠群，总长度为 8405022 碱基对，GC 含量为 63%。第一个重叠群代表一个 8193764 碱基对的环形核基因组，GC 含量为 63%；第二个重叠群是一个 214646 碱基对的环形质粒，GC 含量为 60.5%。Bradyrhizobium sp. RDM4 与 B. rifense CTAW71^T亲缘关系较近，ANI 值为 88.42%，dDDH 值为 33.5%。注释结果显示，该菌株共有 7032 个蛋白质编码基因、3 个 rRNA 操纵子、50 个 tRNA 和 2 个 tmRNA。