“标记性染色体差异消除”：高效生产非转基因雄性蚊子，助力蚊媒传染病防控

这篇研究利用自然和工程化的性连锁隐性致死等位基因（RLAs），开发了 “标记性染色体差异消除”（DeMark）技术，可在单一菌株中高效生产非转基因雄性蚊子，为蚊媒传染病防控提供了新策略，有望解决遗传控制项目中的性别分离难题。

　　

研究背景

埃及伊蚊（Aedes aegypti）是传播登革热、寨卡等病毒的主要媒介。蚊媒传染病的防控主要依赖有效的病媒控制，但杀虫剂抗性增加阻碍了这一进程。目前，新型遗传策略如种群抑制（如不育昆虫技术 SIT 和基于沃尔巴克氏体的不相容昆虫技术 IIT ）和种群修饰（利用基因驱动机制使目标种群对疾病传播产生抗性）被积极探索。这些策略大多需要释放雄性蚊子，因为雌性蚊子可能叮咬并传播病原体，所以性别分离是遗传控制项目的关键步骤，但目前高效的性别分离仍是一个重大瓶颈。

研究内容

1. 测量埃及伊蚊性位点附近的低重组率：埃及伊蚊的性位点位于重组荒漠区域。研究人员利用性连锁标记，通过筛选大量后代来测量性位点（M 位点）与附近标记之间的遗传距离。例如，转基因插入 C1（表达 DsRed 荧光标记，插入位置 167.945Mb）和 P14（表达 GFP 荧光标记，插入位置 180.261Mb）与 M 位点的平均重组率分别为 0.043% 和 0.079%，远低于全基因组平均重组率，这为后续研究提供了重要基础。
2. 自然发生的性连锁隐性致死等位基因：M 位点与 C1 转基因标记之间的重组事件导致了 DsRed 阴性雄性（M 染色体上失去标记）和 DsRed 阳性雌性（m 染色体上获得标记）的出现。研究发现，野生型 M 染色体可能携带至少一个隐性致死等位基因（l）。例如，Mm^C1A雄性后代死亡，而 M1m^C1A雄性（M1 可拯救致死性）存活，且 m^C1Am^C1A雌性也可能因继承两个 m^C1A染色体而致死，这表明该致死性可能是隐性且非性别特异性的。
3. 通过差异消除 2 个标记性染色体（De2Mark）生产非转基因雄性蚊子：基于 M1 可拯救由l导致的致死性，研究人员设计了一种方法。将存活的 M1/m^P14D雄性与 m/m^C1A雌性杂交，预期可产生三种存活表型：M1/m 雄性、M1/m^C1A雄性和 mm^P14D雌性，而双阳性的 m^C1Am^P14D雌性因含有相同的隐性致死等位基因l而死亡。通过荧光筛选，可将无转基因标记的 M1/m 雄性与转基因雄性和雌性分离。而且，该方法可连续生产非转基因雄性，同时利用两种不同的转基因标记追踪菌株稳定性并去除重组体。
4. 工程化性连锁隐性致死等位基因以扩展 DeMark 设计选项：利用埃及伊蚊性染色体的同型性，研究人员通过 CRISPR/Cas9 介导敲除性位点附近的必需但单倍体充足基因，创造额外的性连锁隐性致死等位基因。选择了amon（AAEL014523，与 M 位点紧密连锁）和bag（AAEL006597，与 P14 标记紧密连锁）进行敲除。实验证实，bag^-和amon^-突变均导致隐性致死表型。
5. 差异消除 1 个标记性染色体（De1Mark）产生连续生产非转基因雄性和转基因雌性的单一菌株：结合自然（l）和工程化（如amon^-或bag^-，用 k 表示）的隐性致死性，研究人员设计了一种只产生非转基因雄性和转基因雌性后代的方法。以bag^-为例，将 Mm^bag-雄性与 m^bag-m^P14D雌性杂交，由于染色体上的隐性致死等位基因，特定组合的后代死亡，最终产生的后代为 Mm^bag-雄性和 m^bag-m^P14D雌性，可通过 GFP 标记轻松分离。
6. De1Mark_bag 雄性在实验室条件下与 LVP 雄性交配竞争力的比较：对 De1Mark_bag菌株产生的非转基因雄性进行交配竞争力评估，与 LVP 雄性进行竞争实验。通过数字液滴 PCR（ddPCR）检测雌性后代中bag突变等位基因的拷贝数来判断交配对象。结果显示，De1Mark_bag雄性与 LVP 雄性在平均交配次数上无显著差异，统计功效超过 80%。

研究讨论

1. 当前 DeMark 菌株的优势：DeMark 在单一自我维持菌株中生产非转基因雄性，与需要维持两个转基因品系且涉及三次性别分离的方法相比，具有显著的操作和成本优势。De1Mark 中雌性均为转基因，雄性非转基因，可基于转基因标记的有无进行性别分离；De2Mark 中标记在连续世代中在两性间交替，可用于去除重组体和监测稳定性。
2. 提高 DeMark 稳定性：重组是许多遗传性别鉴定菌株稳定性的挑战。目前的 DeMark 菌株中，C1 和 P14 标记与 M 位点的重组率很低，且l与 M 位点以及 C1、P14 标记紧密连锁。为进一步提高稳定性，可将标记尽可能靠近 m 位点插入，或诱导性位点与标记之间的染色体倒位，还可采用特定的 De2Mark 设计，使标记与隐性致死等位基因紧密连锁且位于性位点两侧，便于去除重组后代。
3. 标记 m 染色体作为 “工程游乐场”：无需筛选的全雄性生产：标记的 m 染色体不会传递给非转基因雄性（罕见重组事件除外），因此可对其进行工程改造，添加条件致死盒等。未来可通过化学或光诱导选择实现非转基因雄性的生产，避免生产阶段的性别分离，提高效率和成本效益，但选择反选择系统时需考虑对蚊子微生物群的影响。
4. 其他实际考虑因素：De2Mark 系统可产生完全非转基因雄性，能与当地遗传背景的菌株充分融合，产生有竞争力且适应本地的雄性；而 De1Mark 系统产生的雄性含有单倍体充足基因的敲除等位基因，其竞争力可能受影响。在进行试点试验前，需在大规模饲养条件下研究系统的稳定性和产生雄性的竞争力。
5. DeMark 也可为具有异型 X 和 Y 染色体的按蚊属物种生产非转基因雄性：De2Mark 概念可应用于按蚊属蚊子。通过敲除按蚊 X 染色体上的必需但单倍体充足基因，创建隐性致死等位基因（d），并携带可选择标记。XX^d雌性与 X^dY 雄性交配后，可产生非转基因 XY 雄性用于释放，XX^d和 X^dY 个体用于维持品系。虽然尚未在按蚊中进行转基因品系测试，但在埃及伊蚊中的成功为其应用提供了理论基础和遗传试剂。

研究总结

本研究利用自然发生和工程化的性连锁 RLAs，开发了具有成本效益和操作友好的性别分离方法，用于生产非转基因雄性蚊子。这些 DeMark 方法具有广泛的应用潜力，可与现有的 SIT/IIT 项目整合，尤其是在优先释放非转基因雄性的情况下，为全球蚊媒传染病防控提供了重要的新工具。