探秘 RNA “锁钥”：新小分子精准靶向真菌内含子，开启抗菌新药研发新征程

本文利用高通量筛选、药物化学和结构生物学技术，鉴定出针对真菌 I 型内含子的新型剪接抑制剂。通过冷冻电镜解析复合物结构，揭示 RNA - 配体识别机制及动态变化，为 RNA 靶向药物设计提供关键依据，推动抗菌新药研发。

　　

研究背景

用小分子靶向并调控 RNA 功能在药物研发领域极具潜力，有望大幅拓展可成药基因组，使针对非编码基因或难以从蛋白质水平靶向的基因进行药理干预成为可能。然而目前，RNA - 药物相互作用的分子机制研究受限。一方面，功能性 RNA 结合分子的发现常依赖偶然，现有以靶点为中心的方法因常规化学空间筛选命中率低而难以适用，且缺乏高效的高通量筛选（HTS）兼容检测方法来监测小分子结合的生化或表型结果。另一方面，可视化 RNA - 配体相互作用原子细节的通用结构方法不足，X 射线晶体学受限于功能相关 RNA 分子及复合物的大小，小角 X 射线散射（SAXS）和核磁共振光谱（NMR）分别存在分辨率低和适用分子大小受限的问题。冷冻电镜（cryoEM）虽在解析小分子与大蛋白复合物结构上成果显著，但在解析 RNA - 小分子复合物结构方面尚处起步阶段，分辨率有限。为挖掘 RNA 靶向的巨大潜力，研究人员选择了致病真菌线粒体中一种特殊的、高度结构化的 I 型内含子，建立系统方法筛选并优化 RNA 配体，借助 cryoEM 揭示分子识别策略及配体结合的动态影响。

研究结果

1. 高通量筛选识别 I 型内含子剪接抑制物：研究人员发现白色念珠菌（Candida albicans）线粒体 rRNA 中的 I 型 A1 内含子（C.a.mtLSU）是潜在的泛真菌药物靶点。他们运用分子信标构建高通量化学筛选平台，对大型化合物库进行筛选，从 Enamine RNA 聚焦库中筛选出有效抑制剂（0.2% 表观命中率）。经剂量 - 反应放射性分析检测排除假阳性，并测试对不同类型 II 型内含子自我剪接的影响以验证特异性。其中，Enamine 目录中的 Z3686288076 是具有中等效力和选择性的抑制剂（IC₅₀为 0.84 μM），基于其结构确定化合物 1 的药效基团为嘧啶与吡咯烷共轭结构。Lineweaver - Burk 图表明化合物 1 是竞争性抑制剂（K_i为 0.67 μM），结合在保守的鸟苷结合位点。
2. 命中扩展产生强效剪接抑制剂：为探究化合物 1 效力的分子决定因素，研究人员进行详细的构效关系（SAR）研究。合成环 B 上氨基和甲氧基的四种立体异构体，发现顺式异构体均保持抑制活性；改变环 B 上的氧取代基和伯胺绝对构型对抑制活性影响较小，环 B 结构本身对功效贡献不大，但伯胺至关重要，替换后抑制活性显著降低。引入乙烯连接子替代环 B 得到化合物 11，其效力高，被选用于后续结构研究。研究还发现，改变环 A 上的取代基，如 N1 位置的杂原子、5 - 位的电子基团以及 2 - 位的胺取代基等，会影响化合物的抑制活性。
3. cryoEM 解析内含子与鸟苷辅因子结合结构：在研究化合物与内含子的结合前，研究人员利用 cryoEM 解析 C.a.mtLSU 内含子与鸟苷的分子相互作用网络。以钙为金属离子捕获未剪接前体 RNA 与鸟苷单磷酸（GMP）的复合物，获得 3.1? 分辨率的重建结构并构建原子模型。该结构显示结合的鸟苷 3′ - OH 靠近可切割磷酸和催化金属 M_C，处于剪接第一步前的预催化状态。cryoEM 重建还揭示该 I 型内含子具有典型三维结构，同时存在两个独特结构模块（P7ext 和 P9.1），它们支撑内含子活性位点，通过 P11 假结、P7ext 与 P9.1 的三级相互作用以及独特的堆叠三明治结构，增强了内含子核心元件的关联。
4. cryoEM 解析内含子 - 抑制剂复合物揭示分子识别机制：研究人员解析了内含子与化合物 11 在 Mg^{2 +}或 Ca^{2 +}存在下的复合物结构，分辨率分别为 2.4? 和 2.5?，重点分析 Mg^{2 +}条件下的结构。在靠近内含子 P7 的口袋中确定了与化合物 11 对应的强电子密度区域，其质量足以准确放置化合物 11，Q 分数为 0.79。比较化合物 11 与 GMP 的结合发现，化合物 11 的 2 - 氨基嘧啶支架模拟鸟嘌呤碱基，与 G154:C258 形成类似碱基三联体并堆叠在 A152 上；乙二胺尾部与 A152、A253 的磷酸基团通过静电和氢键相互作用，桥连氮原子与 A253 的 2′ - OH 结合，形成比 GMP 更广泛的相互作用网络，从而有效竞争结合内含子。
5. 抑制剂诱导内含子活性位点重排：高分辨率的抑制剂结合 RNA 结构显示，配体结合导致活性位点附近金属离子占据和配位发生改变。催化金属 M_C在化合物 11 结合结构中缺失，可能是由于配体几何形状改变和抑制剂末端氨基的静电排斥，使得催化金属 M_A向 M_C原本位置移动。同时，结构金属 M_E出现，其配位的水分子与化合物 11 的桥连氮原子形成氢键，参与抑制剂识别，这解释了替换桥连氮原子会降低抑制活性的现象。此外，内含子的 ωG 核苷酸在化合物 11 结合时进入新的小腔，与 A152:U259 形成碱基三联体，封闭鸟苷结合口袋，限制抑制剂解离。
6. RNA - 配体识别的动态策略：研究人员比较内含子与 GMP、化合物 11 结合的结构，发现化合物 11 结合后，内含子整体结构折叠保持，但 P1 螺旋发生较大构象变化。ωG 推动 P1 螺旋上移，使可切割磷酸远离催化核心，同时 P1 螺旋在 A (- 6) 和 U (- 7) 之间形成尖锐扭结，5′ - 外显子折叠回形成 5′ - 外显子 - IGS 螺旋和短三螺旋，稳定 P1 螺旋基部，防止其完全脱离。这些变化表明 RNA 在结合新配体时具有构象可塑性，识别过程包括锁钥识别和诱导契合策略。

研究讨论

本研究通过化学筛选、SAR 分析和优化，鉴定出强效选择性 I 型内含子剪接抑制剂，并借助 cryoEM 高分辨率揭示其与内含子的相互作用网络和动态识别策略，建立了完全基于结构合理化的 SAR，在 RNA 靶向领域具有重要意义。从药物化学角度，研究结果支持新兴的 RNA 靶向配体设计原则，如含高氮含量药效基团的重要性。cryoEM 结构分析揭示了 SAR 观察无法发现的配体识别机制，RNA 相关金属离子和水分子以及 RNA 构象动态变化在配体识别中起关键作用。在更广泛层面，研究结果为虚拟小分子筛选和 RNA 结构预测数据库提供重要数据，有助于提高计算机模拟准确性，推动 RNA 靶向小分子疗法的发展。本研究结合多种技术，为 RNA 靶向领域提供范例，将促进更高效的药物研发。

研究方法

1. 体外剪接抑制试验：从 Enamine 购买筛选得到的化合物及商业类似物，部分化合物由内部合成纯化。将化合物溶解在 DMSO 中配制成 10 mM 储备液用于体外生化实验。体外剪接抑制试验中，先对自剪接前体 RNA 进行热变性和复性处理，加入化合物和鸟苷启动反应，通过聚丙烯酰胺变性凝胶分析不同时间点的反应情况。进行 IC₅₀分析前，先测定 10 μM 化合物的剪接时间进程和观测速率常数（k_obs），对符合条件的化合物进行 IC₅₀测定，通过 Lineweaver - Burk 分析确定抑制模式。
2. 内含子 - 配体复合物的形成与纯化：用于结构研究的内含子 RNA 构建体带有 A9U 突变以稳定 P1 茎，转录后经热变性和复性处理，在相应缓冲液中用 AKTA pure 系统和 Superdex 200 Increase 10/300 GL 柱纯化。纯化后的内含子 RNA 与 GMP 或化合物 11 共孵育，使最终 RNA 浓度为 1 μM，配体浓度为 5 mM。
3. 网格制备与数据采集：制备内含子 - GMP 复合物和内含子 - 化合物 11 复合物的网格时，分别将溶液滴加到处理后的网格上，在特定湿度和温度下进行 blotting 操作后迅速冷冻。使用 Glacios 显微镜筛选网格，选择合适的网格用于数据采集。对内含子 - GMP 复合物，在 Titan Krios 显微镜上以特定参数采集数据；对内含子 - 化合物 11 复合物，在 Titan Krios 显微镜上，利用 Falcon 4i 直接检测相机以计数模式采集数据。
4. cryoEM 数据处理：使用 cryoSPARC v4.4.1 对记录的电影帧进行处理，包括运动校正、CTF 估计等。对粒子进行自动拾取、2D 分类筛选，用 Topaz 训练和拾取粒子，进行异质性细化、全局和局部 CTF 细化以及局部细化，得到最终重建图。使用 Phenix 1.20.1 对最终图进行自动锐化，用 PyMOL 2.5.4 和 UCSF Chimera 进行可视化。
5. 模型构建与优化：以Twort病毒 I 型内含子（PDB: 1Y0Q）为初始模型，在 COOT 中手动调整和重建内含子与 GMP 的原子结构，根据已有知识放置金属离子。将该模型对接至化合物 11 - 内含子复合物，用 NAMDINATOR 进行柔性拟合，在 PHENIX 中进行实空间优化，在 COOT 中进行重建，得到最终模型。