综述：日本血吸虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂（Sj-Cys）通过诱导耐受性树突状细胞（TolDCs）和调节性 T 细胞（Tregs）减轻小鼠盲肠结扎穿孔（CLP）诱导的败血症

本文聚焦败血症治疗难题。研究发现日本血吸虫分泌的 Sj-Cys，其重组蛋白（rSj-Cys）能诱导小鼠骨髓来源的树突状细胞（BMDCs）转变为 TolDCs。将其回输小鼠可减轻 CLP 诱导的败血症，机制涉及上调 Tregs，调节炎症因子。这为败血症治疗提供新思路。

　　

背景

败血症是一种危及生命的多器官功能障碍综合征，由严重细菌感染和（或）感染因素导致宿主免疫反应失调引起。病情进一步发展可引发感染性休克，死亡率在 30% - 70%。在败血症中，细菌脂多糖（LPS）会诱导巨噬细胞等免疫效应细胞释放大量促炎细胞因子，引发细胞因子风暴，进而导致全身炎症反应。

重组 Sj-Cystatin 蛋白的表达与纯化

编码全长 Sj-Cys（GenBank: CAX73577.1）的 DNA 从日本血吸虫成虫的总 cDNA 中扩增得到，使用的引物为（正向：5′-CAG AAT TCA TGC CTT TAT GTT GTG GTG GT G-3′；反向：5′-GCC TCG AGT TAG AAA TAA TAG AAA TGT AAC AGC-3′） ，随后利用 EcoRI 和 XhoI 酶切位点将其克隆到 pET-28a (+)（美国 Promega 公司）载体中。经双链 DNA 测序确认重组质粒阅读框和编码序列正确后，将其转化到原核细胞中。最终，Sj-Cys 在大肠杆菌 BL21 (DE3) 中成功表达为可溶性重组蛋白（rSj-Cys）。SDS-PAGE 结果显示，纯化后的 rSj-Cys 大小约为 11kDa，与根据氨基酸序列预测的分子量（11.3kDa）相符。经过内毒素去除柱纯化后，污染的内毒素降低至小于 0.06 EU/mg。

盲肠结扎穿孔诱导的败血症小鼠模型

选用 6 - 8 周龄、体重 18 - 22g 的无特定病原体感染的雄性 C57BL/6 小鼠，购自合肥清源生物技术有限公司，饲养于可控环境（12 小时光照 / 12 小时黑暗循环，温度 22±2°C，相对湿度 55%），自由摄食和饮水。基于先前描述的方法，通过盲肠结扎穿孔（CLP）建立临床相关的啮齿动物败血症模型。实验前，C57BL/6 小鼠需禁食。

BMDCs 的培养与诱导

按照先前方法从 C57BL/6 小鼠股骨中提取骨髓细胞，使用红细胞裂解液（中国 Biosharp 公司）裂解污染的红细胞。将剩余的骨髓细胞以 1×10⁶/ml 的密度接种于 6 孔板（每孔 2ml），在含有 10% 胎牛血清（美国 Gibco 公司）、100 U/ml 青霉素（中国 Beyotime 公司）和链霉素（中国 Beyotime 公司）的完全 RPMI-1640 培养基（美国 Gibco 公司）中，于 5% CO₂、37°C 培养箱中培养。在 GM-CSF 和 IL-4 共同培养 6 天后，成功诱导出骨髓来源的树突状细胞（BMDCs），其表面高表达 CD11c。

败血症小鼠血清和组织中细胞因子变化的检测

手术后 12 小时采集小鼠血液样本，分离血清。将每只安乐死小鼠的肝脏、肺和肾脏组织各 50mg，在 450μl PBS 中匀浆，10,000 xg 离心 10 分钟获得组织匀浆。使用 BCA 检测试剂盒（中国 Biosharp 公司）测定组织匀浆中的蛋白质浓度。同时检测血清和组织中的促炎细胞因子 TNF-α 和 IL-6，以及调节性细胞因子 IL-10 和 TGF-β。

统计学分析

所有分析的数据均来自至少三个独立实验。使用 GraphPad Prism 8.0 软件（美国 GraphPad Software 公司）进行组间统计学差异分析，结果以均值 ± 标准误表示。采用 Shapiro-Wilk 正态性检验，以及单因素方差分析（ANOVA），随后进行 Tukey-Kramer 或 Tamhane 多重比较检验。使用生存分析比较各组间的生存率差异。

rSj-Cys 对 BMDCs 的耐受性诱导作用

在 LPS 刺激下，CD11C⁺的 BMDCs 表面 MHC-II、CD40 和 CD86 的表达强烈上调，同时促炎细胞因子 TNF-α 和 IL-6 水平升高，这些都是抗原呈递细胞（APSc）的明显标志物。然而，当与 rSj-Cys 共孵育时，情况有所不同。

肝脏

对败血症小鼠肝脏组织进行组织病理学观察发现，与假手术小鼠相比，败血症小鼠肝索紊乱、肝细胞肿胀、炎症细胞浸润，肝损伤评分显著升高。而在过继转移耐受性树突状细胞（TolDCs）后，肝损伤评分明显降低。接受成熟树突状细胞（mDCs）过继转移的败血症小鼠炎症更严重，肝损伤评分显著更高（ANOVA: F_(3,20)= 413.4, P）。

肺

败血症小鼠的肺组织，无论是否接受 mDCs 过继转移，肺泡结构均严重受损，肺泡间隔增厚、破坏并伴有炎症细胞浸润，肺损伤评分相较于假手术小鼠显著增加。过继转移 TolDCs 后，败血症诱导的肺组织损伤和病理变化明显减轻，肺损伤评分低于未进行细胞转移的败血症小鼠。

肾脏

与假手术小鼠的肾脏相比，败血症小鼠的肾脏组织病理表现为肾小球破坏、肾小球扭曲水肿、肾小管细胞水肿，以及大量炎症细胞浸润。过继转移 TolDCs 后，败血症诱导的肾脏损伤减轻，肾脏损伤评分显著降低（ANOVA: F_(3,20) = 229.6, P＜0.0001）。过继转移 TolDCs 抑制促炎细胞因子并诱导调节性细胞因子产生。

TolDCs 诱导败血症小鼠 Treg 细胞分化

为评估 TolDCs 对体内 Treg 细胞分化的影响，采用荧光激活细胞分选技术（FACS）检测不同处理组小鼠脾脏 CD3⁺CD4⁺T 细胞中 CD25⁺Foxp3⁺Treg 细胞的比例变化。与假手术组相比，所有 CLP 手术组的 CD3⁺CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Treg 细胞百分比均有所增加（ANOVA: F_(3,20)= 118.5, P＜0.0001）。其中，过继转移 TolDCs 的组中，该比例增加更为显著。

讨论

败血症仍是外科和重症监护患者的主要死因，主要源于细菌的超级感染和免疫反应失衡。细菌 LPS 诱导的过度炎症反应和细胞因子风暴会导致多器官衰竭甚至死亡。通过免疫治疗减轻过度炎症反应并诱导调节性反应，已成为降低败血症死亡率的有前景的方法。越来越多证据表明，寄生虫感染可调节宿主免疫系统，本研究中日本血吸虫来源的 Sj-Cys 展现出的免疫调节作用，为败血症治疗提供了新的方向。

结论

Sj-Cys 是一种源自寄生虫的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，具有重要的免疫调节功能。本研究进一步证实 rSj-Cys 能够诱导 DCs 产生耐受性。过继转移 rSj-Cys 诱导的 TolDCs 可有效降低败血症导致的死亡率和器官损伤，其机制是上调 Treg 细胞比例，增加抗炎细胞因子 IL-10 和 TGF-β 的水平，同时降低促炎细胞因子 TNF-α 和 IL-6 的水平。这一结果表明，rSj-Cys 有望开发成为治疗炎症性或自身免疫性疾病的药物。