新型真菌木葡聚糖酶（AbiXeg12a）：提升木质纤维素糖化效率的关键 “钥匙”

在木质纤维素糖化研究中，木葡聚糖因结构复杂、含量低常被忽视。研究人员对来自白腐真菌的新型 GH12 家族木葡聚糖酶（AbiXeg12a）展开研究。结果显示，其能协同商业纤维素酶促进玉米麸和苹果浆糖化。这为优化酶鸡尾酒设计提供依据。

　　在生物炼制和动物饲料领域，木质纤维素的高效利用一直是研究的热点与难点。木质纤维素是植物细胞壁的主要成分，其包含纤维素、半纤维素和木质素等复杂聚合物。其中，木葡聚糖作为一种复杂且高度取代的植物生物质多糖，虽然在植物中广泛存在，但由于它仅存在于特定植物组织且含量较低，在木质纤维素糖化的酶鸡尾酒设计中常常被忽视，其微生物降解机制也未得到深入研究。然而，在生物炼制理念下，木葡聚糖单体对于高效生物工艺的设计至关重要。而且在植物组织里，木葡聚糖常常覆盖在纤维素微纤丝表面，阻碍纤维素酶与之接触，严重影响纤维素的糖化效率，这一问题制约着木质纤维素在工业生产中的大规模应用。

为了解决这些问题，来自国外的研究人员对一种新型的 GH12 家族木葡聚糖酶（AbiXeg12a）展开了深入研究。该研究成果发表在《Enzyme and Microbial Technology》上，为木质纤维素的高效利用提供了新的思路和方法。

研究人员开展的主要研究及关键技术方法如下：

• 基因克隆与表达：从白腐真菌（Abortiporus biennis）基因组中筛选出编码 AbiXeg12a 的基因，经密码子优化后克隆至表达载体，转入毕赤酵母（Pichia pastoris）中进行异源表达，之后利用固定化金属离子亲和层析（IMAC）技术纯化目的蛋白 。
• 酶学性质表征：通过在不同 pH 和温度条件下，以木葡聚糖为底物测定酶活性，确定 AbiXeg12a 的最适反应条件；利用不同浓度的木葡聚糖底物测定米氏常数（K_M）、最大反应速率（V_max）等动力学参数；以多种多糖为底物，检测 AbiXeg12a 的底物特异性。
• 产物分析：运用薄层层析（TLC）和高效阴离子交换色谱（HPAEC）技术分析 AbiXeg12a 水解木葡聚糖的产物，探究其作用模式。
• 分子建模：借助 Alphafold 构建 AbiXeg12a 的模型结构，运用相关软件进行多序列比对和结构分析，研究其活性位点结构特征。
• 协同作用研究：将 AbiXeg12a 与商业纤维素酶（Cellic?Ctec2）混合，以玉米麸和苹果浆为底物进行糖化实验，通过测定还原糖释放量评估协同效果，并研究不同添加顺序和比例对糖化效果的影响 。

下面来详细看看具体的研究结果：

• AbiXeg12a 的表达与纯化：AbiXeg12a 基因经克隆、表达和纯化后，SDS-PAGE 电泳显示纯化产物存在多条带，经 EndoH 处理后出现单一约 28.5 kDa 的条带，表明其为糖蛋白，这与生物信息学预测的糖基化位点相符。
• 生化特性：AbiXeg12a 的最适反应 pH 为 4.5，最适反应温度为 55°C ，在 pH 3 - 6 和 40 - 60°C 范围内能保持较高活性，属于中温酶。其 K_M为 3.3 ± 0.4 mg?mL^?1，V_max为 596.2 ± 23.3 U mg ^?1，k_cat为 28.8 ± 1.6 s^?1，催化效率（k_cat/K_M）为 8.7 ± 1.12 mL?s^?1·mg^?1，与其他真菌 GH12 家族木葡聚糖酶相当。
• 底物特异性：AbiXeg12a 对木葡聚糖具有高度特异性，在纤维素类底物（如 CMC、Avicel）上活性极低。此外，它对 β - 葡聚糖也有一定活性，但比在木葡聚糖上的活性低 15 倍。TLC 和 HPAEC 分析表明，其水解木葡聚糖的主要产物为 XXXG、XLXG/XXLG 和 XLLG，且作用模式为内切解离型。
• 分子结构特征：Alphafold 构建的模型显示，AbiXeg12a 具有典型的 GH12 家族 β - 果冻卷折叠结构，其活性位点包含 Glu218 和 Glu125 两个催化残基。与结构相似的 Aspergillus aculeatus XEG 相比，AbiXeg12a 在底物结合位点的部分氨基酸存在差异，这可能影响其对底物的特异性和催化活性。
• 协同作用：AbiXeg12a 与商业纤维素酶 Cellic?Ctec2 协同作用于玉米麸和苹果浆糖化时，能显著提高还原糖的释放量。在玉米麸糖化实验中，当 Cellic?Ctec2 用量为 1.25 mg?g^?1生物质，AbiXeg12a 与 Cellic?Ctec2 质量比为 1/5 时，协同系数（DS）可达 1.39；在苹果浆糖化实验中，当 Cellic?Ctec2 用量为 2.5 mg?g^?1生物质，AbiXeg12a 与 Cellic?Ctec2 质量比为 30% 时，DS 为 1.18，且葡萄糖释放量显著增加。同时，研究发现同时添加 AbiXeg12a 和 Cellic?Ctec2 的糖化效果优于顺序添加，并且适量添加 AbiXeg12a 可减少总酶用量。

研究结论和讨论部分指出，AbiXeg12a 作为一种新型的木葡聚糖酶，在木质纤维素糖化过程中展现出了重要的作用。它不仅对木葡聚糖和 β - 葡聚糖具有特异性活性，还能与商业纤维素酶协同作用，显著提高玉米麸和苹果浆等含木葡聚糖底物的糖化效率，增加还原糖的释放量。此外，添加 AbiXeg12a 可以降低反应所需的总酶量，从而降低酶成本，这对于生物炼制和动物饲料等工业过程的酶鸡尾酒设计具有重要意义。该研究首次报道了真菌 GH12 家族木葡聚糖酶与商业纤维素酶的协同增强作用，为木质纤维素的高效利用提供了新的策略和理论依据，有望推动相关领域的技术发展和产业应用。