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当前靛蓝大规模生产面临挑战，微生物细胞色素 P450s 用于靛蓝生产鲜见报道。研究人员对含 CYP105D18 过氧合酶的大肠杆菌无细胞裂解物体外反应优化并诱变其活性位点。结果显示 L87F 突变使活性提升约 12 倍，该单酶系统或可用于商业生物靛蓝生产。
在时尚界，靛蓝作为牛仔裤等织物的经典染色剂，始终占据着重要地位。传统上，人们从植物（如蓼蓝 Indigofera tinctoria）中提取靛蓝，印度种植的相关植物更是重要来源。但植物提取法耗时漫长，随着科技发展，化学合成法逐渐兴起，以邻氨基苯甲酸或苯胺为底物的合成路线在商业上取得了一定成功。然而，化学合成法存在底物有毒、产生化学废料等问题，对环境不够友好。于是，利用生物技术生产靛蓝成为了科研人员关注的新方向。
微生物发酵生产靛蓝，被认为是一种可持续且环保的方式。许多微生物酶系统都被报道可用于靛蓝生产，比如萘双加氧酶、含 FAD 的单加氧酶（FMOs）等。细胞色素 P450 单加氧酶（CYPs）也参与多种氧化反应，但微生物 CYPs 用于靛蓝生产的情况却很少见。一些研究对特定的 CYPs 进行改造，使其能够催化吲哚氧化生成靛蓝，不过这些微生物酶大多存在需要昂贵辅因子或多组分酶系统进行电子转移的问题。此外，非特异性过氧合酶（UPOs）也能催化吲哚氧化，但重组 UPOs 的生产面临挑战，限制了其深入研究。在这样的背景下，研究人员迫切需要找到一种更高效、更经济且更环保的靛蓝生产方法。
为了解决上述问题，来自国外的研究人员开展了关于 CYP105D18 过氧合酶的研究。他们致力于优化利用过表达 CYP105D18 的大肠杆菌无细胞裂解物进行的 H2O2介导的体外靛蓝合成反应，同时对 CYP105D18 进行活性位点诱变，以提高其催化效率。最终，研究发现 CYP105D18 能够催化 H2O2介导的吲哚 C - 3 羟基化反应来合成靛蓝，对活性位点残基进行突变后，L87F 突变体使 CYP105D18 的活性提高了约 12 倍。利用优化后的体系，在 5L 分批发酵中，无细胞裂解物在 20 分钟内可产生 710mg/L 的靛蓝。这一研究成果为商业生物靛蓝生产提供了一种简单高效的单酶系统，有望推动靛蓝生产行业向更环保、更高效的方向发展。该研究成果发表在《Enzyme and Microbial Technology》上。
研究人员在此次研究中运用了多种关键技术方法。首先是蛋白质表达技术，使用富含营养且乳糖诱导的自诱导培养基（AIM）来培养携带 pET28:CYP105D18 的大肠杆菌，以实现 CYP105D18 的高表达。其次是酶活性抑制技术，向无细胞裂解物中添加过氧化氢酶抑制剂（如 250μM 羟胺），抑制其他干扰 CYP105D18 功能的 H2O2利用酶。最后是定点诱变技术，对 CYP105D18 中参与吲哚结合的活性位点残基（如 L87、A235、A282 和 I386）进行突变，探究其对酶活性的影响。
1. CYP105D18 过氧合酶的发现与体外反应优化
研究人员发现 CYP105D18 能够催化 H2O2介导的吲哚 C - 3 羟基化反应合成靛蓝。为优化体外反应，他们对含有 CYP105D18 过氧合酶的大肠杆菌无细胞裂解物进行处理。通过实验对比，发现使用 AIM 培养基并以乳糖诱导，相较于传统的 LB 培养基和 IPTG 诱导，能使细胞密度（OD600）提高 6 倍以上，从 100mL 培养物中可获得约 4g 湿细胞重量。
2. 活性位点诱变提高催化效率
研究人员对 CYP105D18 的活性位点残基 L87、A235、A282 和 I386 进行突变。结果显示，L87F 突变体的 CYP105D18 活性提升约 12 倍，野生型和 L87F 突变体的催化效率分别为 0.01mM?1min?1和 0.12mM?1min?1 ，表明该突变显著增强了酶对吲哚羟基化的催化能力。
3. 大规模发酵生产靛蓝
研究人员采用分批补料发酵技术，利用优化的自诱导培养基进行 5L 发酵，以获取最大细胞重量用于大规模生产。最终，经破碎的细胞无细胞裂解物在 20 分钟内产生了 710mg/L 的靛蓝，实现了较高的靛蓝产量。
研究人员成功发现 CYP105D18 过氧合酶可作为一种简单快速的单酶系统用于靛蓝生产。通过对体外反应的优化、活性位点的诱变以及大规模发酵条件的摸索，显著提高了靛蓝的产量和酶的催化效率。这一研究成果不仅为靛蓝的生物合成提供了新的策略，还克服了以往微生物酶用于靛蓝生产时存在的诸多问题，如依赖昂贵辅因子和多组分酶系统等。该单酶系统有望成为商业生物靛蓝生产的高效方法，对推动靛蓝产业的可持续发展具有重要意义。未来，基于这一研究成果，或可进一步优化反应条件、探索更多酶工程改造策略，以进一步提高靛蓝的生产效率和质量，拓展其在工业生产中的应用。
