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葡萄糖二酸（GA）生产面临难题，化学合成有毒且产率低，酿酒酵母发酵也有局限。研究人员以毕赤酵母（K. phaffii）为对象，通过代谢工程和补料分批发酵提升 GA 产量，最高达 17.6 g/L，为 GA 合成提供绿色技术方案。
在生物制造领域，葡萄糖二酸（Glucaric acid，GA）是备受瞩目的生物质衍生关键生物添加剂。它在食品、化工和制药等行业用途广泛，就像一把万能钥匙，能开启诸多产品创新的大门。然而，获取 GA 的道路却充满坎坷。从天然来源提取，GA 含量微乎其微，如同在茫茫大海里捞针，根本无法满足市场需求。传统化学合成方法更是问题重重，不仅要使用有毒化学物质，而且产率低下，还会释放有毒副产物，这在对安全性要求极高的食品工业中，无疑是一道道难以跨越的障碍。微生物发酵法虽被视为绿色希望，但现有发酵体系也并非十全十美。比如在大肠杆菌中表达真核加氧酶困难重重，酿酒酵母（
Saccharomyces cerevisiae）发酵时又面临乙醇发酵、氧化还原策略限制等难题。
为了突破这些困境，来自国内的研究人员开展了一项极具意义的研究。他们把目光聚焦在毕赤酵母（Komagataella phaffii，曾用名Pichia pastoris）上，这种工业上重要的酵母表达宿主，或许隐藏着提升 GA 产量的关键密码。研究人员精心设计了一套代谢策略，通过一系列操作，最终成功提升了 GA 的产量。这一成果意义非凡，它为 GA 的可持续、低成本、绿色合成提供了全新的技术方案，有望彻底改变 GA 的生产格局。该研究成果发表在《Enzyme and Microbial Technology》杂志上。
研究人员采用了多种关键技术方法。首先是基于基因表达谱的代谢工程技术，运用融合克隆（in - fusion cloning）手段构建生产 GA 的基因盒；其次，利用补料分批发酵技术，通过添加关键代谢物肌醇（myo - inositol）等底物，优化代谢通量；最后，运用 HPLC 和 LC - MS 技术对发酵样品中的 GA 及其前体进行定量分析 。
结果与讨论
本次研究旨在提升毕赤酵母中 GA 的产量，弥补酿酒酵母在 GA 表达方面的不足。虽然在酿酒酵母中 MIOX 途径和肌醇的作用已被充分研究，但毕赤酵母在生产像 GA 这样具有工业价值产品方面的优化却鲜有人探索。这为研究人员提供了一个契机，通过对毕赤酵母生物合成途径的工程改造，有望提高 GA 的产量。
研究人员构建了含有五个部分基因盒的毕赤酵母 X33 重组菌株，包括过表达的肌醇 - 1 - 磷酸合酶（IPS）、肌醇单磷酸（IMP）、肌醇加氧酶（MIOX）、异源表达的 NADH 氧化酶基因（NOX）和糖醛酸脱氢酶（UDH）基因，这些基因由 GAP 启动子和转录终止子控制。
通过补料分批发酵实验，研究人员发现，添加关键代谢物肌醇能显著提升 GA 的产量。这是因为肌醇可上调K. phaffii X33 中的限速酶MIOX，促进代谢途径向生成 GA 的方向进行。进一步优化发酵条件，采用混合底物（肌醇 + 谷氨酸钠）进行补料分批发酵时，工程菌（X33 - GA）合成 GA 的能力大幅提升，产量达到了 17.6 g/L。此外，研究人员还优化了UDH基因的表达，通过辅因子循环和密码子优化，增强了相关酶的活性，从而提高了 GA 的合成效率。
结论与讨论
自然界中 GA 含量稀少，传统化学合成因其毒性问题在食品行业受限。本研究提供了一种可扩展的酶促途径工程方法，通过发酵提升 GA 产量。肌醇的添加激活了K. phaffii X33 中的限速酶MIOX，使毕赤酵母有望成为 GA 合成的优质细胞工厂。代谢工程手段用更高效的基因替换了毕赤酵母的天然基因，优化了生物合成途径。这一研究成果为 GA 的工业化生产开辟了新方向，为绿色生物制造提供了有力支撑，在生物工程领域具有重要的理论和实践价值，有望推动相关产业的可持续发展。
