半理性设计提升丝状栖热菌 4-α- 葡聚糖转移酶（4GT）催化活性的研究

在食品和制药行业，开发高转糖基化产率且热稳定的淀粉修饰酶迫在眉睫。研究人员对丝状栖热菌 4GT 进行半理性设计，优化突变体 M3 比野生型比活提高 3.76 倍，70℃孵育 24h 后活性仍超 50%，为 4GT 蛋白工程提供理论基础。

　　在生物制造的奇妙世界里，酶就像是一个个神奇的 “小工匠”，它们能精准地构建各种复杂的分子结构，对食品和制药行业意义非凡。其中，4-α- 葡聚糖转移酶（4GT）更是一位能将普通淀粉改造成具有特殊功能 “材料” 的高手，它能让淀粉具备形成热可逆凝胶等独特性质，这在食品加工和药品研发中都大有用处。然而，寻找那些既耐热又有高催化活性的 4GT，就像在茫茫大海里捞针一样困难。目前，虽然已经发现了不少 4GT，但经过详细研究并确定其催化活性的只是少数，而且在提高 4GT 催化效率方面，科学家们也遇到了重重阻碍。这主要是因为 4GT 的结构信息还不够完善，对其底物通道以及酶与底物结合的方式也了解有限。为了突破这些困境，国内研究人员开启了一场探索之旅。

他们开展了一项旨在提升丝状栖热菌（Thermus filiformis）来源的 4GT 催化活性的研究。研究人员首先通过在 UniProt 数据库里 “大海捞针”，经过筛选和对比，发现了丝状栖热菌的 4GT（TfGT），它不仅热稳定性不错，催化活性也比较突出。为了让它变得更 “厉害”，研究人员运用基于蛋白质序列保守性分析的半理性设计方法，对它进行了一系列改造。最终得到的优化突变体 M3（Q60S/Y452I/R455K）表现十分惊艳，其比活相比野生型（WT）酶提升了 3.76 倍，而且在 70℃的环境中孵育 24 小时后，仍然能保持超过 50% 的活性。这一成果发表在《Enzyme and Microbial Technology》上，为 4GT 在工业领域的广泛应用带来了新的希望。

在研究过程中，研究人员主要运用了以下关键技术方法：一是生物信息学方法，通过在 UniProt 数据库中挖掘筛选潜在的热稳定 4GT 相关蛋白序列；二是定点突变技术，对 TfGT 活性中心附近的非保守氨基酸进行饱和突变，构建单突变和组合突变体；三是分子动力学模拟技术，用于揭示突变体活性增强的内在机制 。

下面来看具体的研究结果：

1. 嗜热 4GT 的鉴定和表征：研究人员采用生物信息学策略，在 UniProt 数据库中筛选潜在的热稳定 4GT。通过不同方法筛选出相关蛋白序列后，对其进行异源表达水平和催化活性的比较分析，从而确定了丝状栖热菌来源的 4GT（TfGT），为后续研究奠定了基础。
2. 突变体的构建与筛选：以提高 TfGT 催化活性且不影响热稳定性为目标，研究人员对活性中心附近的非保守氨基酸进行饱和突变。经过一系列单突变和组合突变，成功获得了催化活性和稳定性都有所提升的 4GT 变体，其中突变体 M3 表现最为优异。
3. 分子动力学模拟揭示机制：为了解释突变体活性增强的原因，研究人员进行了分子动力学模拟。结果发现，突变体 M3 活性的提高主要得益于底物隧道的重塑，这种变化让底物能够更顺畅地进入活性口袋，从而促进了反应的进行。

在研究结论和讨论部分，研究人员成功鉴定出丝状栖热菌的 4GT（TfGT），并通过基于蛋白质结构的半理性设计和序列保守性分析，获得了具有更高催化活性和热稳定性的突变体。与野生型酶相比，突变体在更宽泛的 pH 和温度范围内表现出更好的耐受性。分子动力学模拟表明，突变体活性增强的关键在于活性位点更加开放，底物通道更利于底物进入。这项研究意义重大，它为 4GT 的蛋白质工程改造提供了重要的理论依据，拓宽了 4GT 在未来工业领域的应用前景，有望推动食品、制药等行业的进一步发展，让 4GT 这一 “小工匠” 在更多领域发挥出更大的价值。