编辑推荐：
本文聚焦循环肿瘤细胞（CTCs）检测的生物标志物。阐述了液体活检检测 CTCs 的优劣，介绍多种与上皮 - 间质转化（EMT）相关及无关的生物标志物，如 PD - L1、vimentin 等，对癌症诊断、治疗和预后评估有重要意义。
一、引言
循环肿瘤细胞（CTCs）在癌症转移中意义重大，它能让癌细胞从原发肿瘤扩散到远处器官。近年来，CTCs 作为癌症诊断、预后评估和监测治疗反应的潜在无创生物标志物备受关注。不过，CTCs 在血液中极为稀少且具有生物异质性，这给检测和分析带来了很大挑战。尽管困难重重，但随着技术进步，现在已经能够分离和对 CTCs 进行分子表征，为癌症转移生物学研究和个性化医疗开辟了新方向。
早期检测 CTCs 对癌症治疗至关重要，这有助于预防癌症转移，而癌症转移正是癌症相关死亡的主要原因。通过在疾病早期识别 CTCs，医生能采用新的治疗方法，有望阻止癌症扩散，改善患者预后。从恶性积液（如胸腔或腹腔积液）中收集的 CTCs，在无法获取组织材料时，可作为癌症 DNA 的替代来源。准确识别 CTCs，检测细胞表面生物标志物是关键，这些标志物不仅能用于检测 CTCs，还能帮助了解其生物学特性，对癌症临床管理意义非凡。
上皮来源的恶性肿瘤，如乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌较为常见，上皮来源的分子标志物成为研究重点。目前该领域的难题与上皮 - 间质转化（EMT）和间质 - 上皮转化（MET）这两个重要过程相关。EMT 过程中，上皮细胞获得间质特征，增强了迁移、侵袭和转移能力；MET 则与之相反，癌细胞外渗并在潜在转移部位形成集落。由于 EMT，CTCs 是异质细胞群体，多数呈现混合表型，同时表达上皮和间质标志物，所以检测和表征特定 CTCs 群体需要上皮和间质标志物。了解调节 EMT 和 MET 过程的蛋白质表达模式，有助于深入了解 CTCs 的转移潜能及其在癌症扩散中的作用。
本文旨在总结 CTCs 领域的最新进展，重点介绍那些有助于检测 CTCs、监测治疗反应和评估转移进展的标志物，期望推动癌症诊断和治疗领域的发展。
二、研究方法
2.1 检索标准
通过 PubMed、Embase、Cochrane Library、Web of Sciences 和 Google Scholar 等多个医学数据库进行全面检索。检索词涵盖 “循环肿瘤细胞（CTCs）”，以及 “锌指 E 盒结合同源盒 1（ZEB1）”“分化簇 44（CD44）”“纤连蛋白（FN）”“上皮 - 间质转化（EMT）”“间质 - 上皮转化（MET）”“ Twist 相关蛋白 1（TWIST1）”“ Snails”“转谷氨酰胺酶 2（TGM2）”“波形蛋白（vimentin）”“钙粘蛋白（cadherins）”“层粘连蛋白（laminins）”“程序性死亡配体 1（PD - L1）”“ Axl 受体酪氨酸激酶”“ GATA3”“ 足突蛋白（podoplanin）”“性别决定区 Y 框 2（SRY - box 2，即 SOX2）”“循环肿瘤 DNA（ctDNA）”“无细胞 DNA（cfDNA）”“肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）”“生物标志物”“癌症生物标志物”“上皮来源生物标志物”“间质来源生物标志物”“循环生物标志物”“肿瘤标志物”“癌基因”“预后生物标志物”“诊断生物标志物”“分子标志物”“外泌体生物标志物”“蛋白质生物标志物”“治疗靶点”“尿液”“血液”“肿瘤积液”“唾液”“母乳”，以及 “乳腺癌”“肺癌”“结直肠癌”“前列腺癌”“胰腺癌”“卵巢癌”“食管癌”“胃癌”“头颈癌”“膀胱癌”“骨肉瘤”“软骨肉瘤”“脂肪肉瘤”“横纹肌肉瘤”“平滑肌肉瘤”“纤维肉瘤”“血管肉瘤”“尤因肉瘤”“滑膜肉瘤” 等特定癌症类型，重点关注 CTCs 在各种上皮和间质恶性肿瘤中的检测、表征及治疗意义相关文章，特别是检测生物标志物（包括预测和预后标志物）以及可能作为标志物的潜在蛋白质。
2.2 纳入标准
研究文章的选择和评估遵循严格标准，符合以下条件的文章被纳入：
- 聚焦癌症相关研究，涵盖癌症生物标志物、检测、预后和诊断标志物等多个方面，涉及上皮和间质恶性肿瘤。
- 报道癌症预后和转移情况，强调基于生物标志物的疾病进展和扩散的重要性。
- 基于针对上皮和间质恶性肿瘤中 CTCs 和 ctDNA 的检测方法报道癌症检测情况。
- 研究尚未广泛确立但有望改善癌症诊断或治疗的新型生物标志物。
- 探索生物标志物检测的联合方法，如将成像技术与分子检测相结合。
- 涉及不同年龄、性别和种族的多样化患者群体，确保研究结果具有广泛适用性。
- 比较不同生物标志物或诊断方法在预测癌症结局或治疗反应方面的有效性。
- 包含纵向数据，以评估生物标志物随时间的变化及其对疾病进展和患者预后的影响。
- 通过独立队列或外部验证研究对生物标志物进行验证，以确认其可靠性和临床实用性。
- 报道正在进行或近期完成的治疗开发试验中使用的生物标志物。
- 报道可能作为标志物的潜在蛋白质和颗粒。
- 分析特定生物标志物的经济影响，确定其成本效益和评估质量。
- 以英文发表，明确标注日期和地点，并被 MEDLINE 收录，确保可获取性和可信度。
2.3 排除标准
排除给编辑的信件、缺乏全文的摘要以及虽与文章内容有一定关联但包含过时数据的研究。
三、CTCs 在研究和临床中的应用
3.1 液体活检
液体活检作为一种新的癌症诊断和研究方法备受关注，它能从体液中提取含有分子物质的癌细胞并进行后续检测。与传统组织活检相比，液体活检是一种微创操作，可获取 CTCs 和 ctDNA，还能动态监测基因组改变和肿瘤演变，有助于提高治疗效果。而且，通过液体活检获得的 CTCs 在制备玻片时无需使用固定剂。因此，基于液体活检的方法有助于提高癌症诊断的准确性，指导治疗决策，避免诊断延误，为患者筛查提供了新选择。
然而，液体活检也存在一些局限性。首先，它无法区分来自原发性和转移性肿瘤部位的细胞，导致其特异性和敏感性不确定，假阴性率较高，这可能会影响诊断和预后评估。为了进行准确分析，获取准确体积的样本至关重要，以尽量减少假阴性结果。由于血液中免疫机制和免疫相互作用会影响 CTCs 的稳定性，其在血液中的含量低于肿瘤积液。CTCs 在血液中通常仅能存活约 10 分钟，所以从体液中获取的 CTCs 更具优势。此外，经验不足的诊断人员可能难以获取高质量和足够数量的基于 CTCs 的材料，完整细胞数量不足也是一个挑战。
3.2 用于 CTCs 检测的典型生物标志物
在致癌过程中，大多数癌症会将核和蛋白质成分释放到血液和体液中，因此 CTCs 上的标志物能很好地指示肿瘤来源，有助于诊断。上皮细胞粘附分子（EpCAM），也称为分化簇 326（CD326），是目前最常用的上皮 CTCs 标志物之一，但目前已证实具有临床效用的标志物数量有限。
大多数 CTCs 生物标志物用于肺癌诊断，在肺癌中区分组织学亚型对合理的治疗干预至关重要。神经元特异性烯醇化酶（NSE）和胃泌素释放肽前体（proGRP）在小细胞肺癌（SCLC）中升高，而癌抗原 15 - 3（CA15 - 3）、癌抗原 125（CA125）、癌胚抗原（CEA）和细胞角蛋白 19 片段（CYFRA 21 - 1）与非小细胞肺癌（NSCLC）相关。此外，程序性死亡配体 1（PD - L1）在肺癌中既是检测标志物，也是基于抗体治疗的治疗靶点。在结直肠癌（CRC）中，细胞角蛋白 20（CK20）、细胞角蛋白 19（CK19）、分化簇 133（CD133）、鸟苷酸环化酶 C（GCC）、存活蛋白（survivin）、粘蛋白 1（MUC1）和粘蛋白 2（MUC2）广泛用于基于 CTCs 的液体活检，用于检测和治疗后监测。在基底细胞癌和转移性腺癌中，抗 EpCAM / 上皮特异性抗原抗体与其他标志物联合使用，可提高检测的敏感性和特异性。表皮生长因子受体（EGFR）的变体 EGFRvIII 用于检测上皮来源的 CTCs，这对了解胶质母细胞瘤和乳腺癌的转移潜能至关重要。
额外的标志物有助于改善上皮来源 CTCs 的检测和表征，为癌症管理中的预后评估和治疗决策提供有价值的信息，帮助临床医生更好地进行癌症诊断、监测和制定个性化治疗策略。
四、EMT 在癌症进展中的作用
4.1 EMT 的亚型
EMT 在 CTCs 发展过程中的动态变化表明，它是 CTCs 具有转移潜能的重要机制。在 EMT 过程中，CTCs 会发生结构和分子改变，获得间质特征，从而增强其侵袭和迁移能力。原本来源于上皮组织的转化 CTCs 失去与其他细胞的粘附，获得更高的移动性，类似于间质细胞。EMT 可分为三种主要亚型，每种亚型在人类生物学中都有独特作用：
- 1 型 EMT 主要发生在器官发生和胚胎发育过程中，在原肠胚形成和神经嵴细胞迁移中发挥重要作用。
- 2 型 EMT 存在于伤口愈合过程中，可触发细胞迁移、生长和器官纤维化。
- 3 型 EMT 与癌症的起始和进展相关，它促使上皮癌细胞迁移，使其能够通过获得间质表型侵入身体的远处部位。
4.2 EMT 在 CTCs 扩散中的作用
EMT 在癌症进展中起着关键作用，细胞内会发生多种变化。其中一个关键变化是 E - cadherin 的下调，导致上皮组织中细胞间粘附减弱。β - catenin 从细胞膜转移到细胞核、vimentin 表达增加以及基质金属蛋白酶（MMPs）产生增多，这些都有助于细胞获得间质特性。EMT 诱导转录因子（如 Twist、SNAI1（Snail 1）和 Snail 2（Slug））的上调启动了与 EMT 相关的基因变化。经历 EMT 的 CTCs 表现出多种间质特征，混合 CTCs 同时显示上皮和间质标志物。
这种由混合 CTCs 体现的异质性对预测癌症患者的治疗反应和疾病进展至关重要。例如，广泛使用的 CellSearch 系统适用于检测上皮 CTCs，但在检测具有间质特征的癌症时效果可能有限。虽然上皮标志物（如 EpCAM 和细胞角蛋白）常用于 CTCs 检测，但由于 CTCs 中存在间质特征，即使是上皮来源的癌症，仅依赖这些标志物也可能不够。间质 CTCs 与更具侵袭性的疾病和更差的预后相关，识别能够表征上皮和间质来源的标志物，对早期癌症检测具有重要意义。
五、与 EMT 相关的 CTCs 检测标志物
5.1 PD - 1 和 PD - L1
PD - 1 是一种主要存在于免疫细胞上的 1 型跨膜蛋白，它与配体相互作用后会传导共抑制信号，导致 T 细胞耗竭和凋亡。这一机制可防止免疫系统攻击健康正常细胞，但也成为癌症适应性反应的重要组成部分，导致局部免疫抑制，促进癌症免疫逃逸。因此，阻断程序性细胞死亡蛋白 1（PD - 1）和程序性死亡配体 1（PD - L1）之间的相互作用，成为近几十年来癌症治疗的重大突破之一。
除了在癌症免疫抵抗中的既定作用外，PD - L1 的激活还会重塑癌细胞表型，改变肿瘤微环境的平衡，促进疾病进展和转移。在 EMT 过程中，PD - L1 的表达会发生变化。在多种癌症中，上皮标志物（如 E - cadherin）与 PD - L1 水平呈负相关，而 PD - L1 的表达会随着 EMT 评分以及间质标志物（如 vimentin 和 SNAIL）水平的增加而上升，这反映了癌细胞获得间质样特征的动态过程。PD - L1 参与 EMT 的机制尚未完全明确，可能因癌症类型而异。例如，在宫颈癌中，PD - L1 直接与整合素家族成员 ITGB4 结合，激活 AKT - GSK3β - Snail1 - β - catenin 信号通路；在三阴性乳腺癌中，PD - L1 的活性促进 EMT，但不影响 AKT 和 ERK1/2 的活性；在胶质母细胞瘤中，PD - L1 与 H - Ras 结合后，MEK/ERK 信号会增强。
与最初的报道相反，PD - L1 介导的 T 细胞抑制似乎更有利于肿瘤在转移部位的生长，而不是在原发性肿瘤部位。此外，CTCs 上 PD - L1 的表达会随着疾病进展而增加，但它与肿瘤中 PD - L1 的表达没有直接关联。PD - L1 阳性 CTCs 的预后意义仍存在争议。虽然 PD - 1/PD - L1 阳性 CTCs 的患者预后较差，但他们对免疫检查点抑制剂的反应良好，CTCs 计数的大幅下降与更长的生存期相关。在多种晚期癌症患者中，较高数量的 PD - L1 阳性 CTCs 与免疫治疗的更大获益和更长的无进展生存期相关。在头颈部鳞状细胞癌研究中，放化疗结束时 PD - L1 阳性 CTCs 的患者生存期更长；在非小细胞肺癌患者中，CTCs 或肿瘤组织中 PD - L1 表达阳性的患者比 PD - L1 阴性的患者无进展生存期更长。关于 CTCs 计数在判断患者预后方面的价值也存在不同报道，例如，鼻咽癌患者每 5 mL 血液中 7 个 CTCs 或＞5 个间质 CTCs 与较差的无进展生存期相关。
上述结果表明，PD - L1 的表达在 CTCs 生物学中起着关键作用，影响肿瘤的侵袭反应和对免疫治疗的敏感性。然而，目前技术能力限制了其在临床实践中的应用，CTCs 的高度异质性也给诊断带来挑战，单一生物标志物用于 CTCs 检测的实用性受到质疑，该领域仍需进一步研究。
5.2 Vimentin
Vimentin 是一种 57 kDa 的中间丝蛋白，构成多种间质细胞（如成纤维细胞、内皮细胞、巨噬细胞、雪旺细胞和淋巴细胞）的细胞骨架，主要位于细胞质中，也可在细胞核中发现。在 EMT 过程中，vimentin 表达增加并转移到细胞表面，这与胶质母细胞瘤细胞的转移潜能相关。
Vimentin 参与 EMT 对癌症进展至关重要。基因改变会降低细胞骨架稳定性，促进癌细胞的侵袭性和移动性。Vimentin 可调节酪氨酸激酶（如 Axl 和 Slug）的活性，激活细胞迁移相关的信号通路，如细胞外信号调节激酶（ERK）信号通路。此外，在三阴性乳腺癌和结直肠癌中，vimentin 在细胞核中的存在会影响与核基质相关的机制，包括 DNA 修复、转录和复制。在 EMT 过程中，vimentin 还与其他信号通路相互作用，例如蛋白激酶 B（AKT）下调共济失调毛细血管扩张突变（ATM）基因，抑制细胞凋亡，促进细胞迁移。Vimentin 在多种恶性肿瘤（如结直肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌和肾癌）中具有重要意义，可能作为 CTCs 的诊断和临床预后标志物，但 vimentin 促进癌症进展的具体机制仍在研究中。
5.3 TWIST1
Twist 是一种具有螺旋 - 环 - 螺旋结构的转录因子，在 EMT 中发挥关键作用。TWIST1 在正常胚胎发育中起介导作用，但在肿瘤细胞中也经常上调，对癌症进展和转移有显著影响。它在调节基因表达、激活癌症干细胞标记基因方面发挥重要作用，通过调节参与细胞粘附、迁移和侵袭的基因表达，促进 EMT 过程。
在乳腺癌中，AKT 对 TWIST1 的磷酸化诱导 EMT 和乳腺癌进展；在肺癌中，TWIST1 的表达与细胞迁移增加和间质样表型的获得相关；在前列腺癌中，TWIST1 调节线粒体氧化代谢，可能有助于代谢重编程。在这些癌症中，TWIST1 都可能作为潜在的 CTCs 诊断标志物和临床预后指标。
目前，TWIST1 的相互作用机制尚未完全明确。在永生化人类上皮细胞和乳腺癌细胞中，TWIST1 过表达会增加蛋白酶激活受体 1（PAR1）的表达，PAR1 是一种 G 蛋白偶联受体，可被丝氨酸蛋白酶特异性激活。PAR1 作为 Hippo 通路的上游调节因子，通过激活参与基因表达调控的 PDZ 结合基序转录共激活因子，增强乳腺癌细胞的侵袭、迁移和癌症干细胞（CSC）样特性。同时，还观察到管腔上皮标志物（尤其是 E - cadherin）增加，间质标志物 N - cadherin 水平也有所上升。
5.4 Snails
Snail 是一类锌指转录因子家族，包括 SNAI1（Snail 1）、Snail 2（Slug）和 Snail 3（Smuc）蛋白。它们具有保守的锌指区域，这对与含有 E 盒序列（CAGGTG）的 DNA 启动子相互作用至关重要。在脊椎动物中，Snail 家族成员的氨基末端含有 SNAG（Snail/Gfi）结构域或 C 末端结合蛋白（CtBP）基
