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为解决从实体器官分离 sEV 时易受细胞破损导致的细胞内囊泡污染的问题，研究人员开展心脏和肝脏组织 sEV 分离方法研究。通过胶原酶处理、差速离心等，得出该方法可高效分离高纯度 sEV 的结果，为相关研究奠定基础。
细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EV）作为细胞间通讯的 “信使”，在调控组织稳态中扮演关键角色。其中，小细胞外囊泡（Small Extracellular Vesicles, sEV，直径 < 200 nm）因其独特的生物学功能备受关注。然而，当前从血液、尿液等大体液中分离 sEV 的技术已相对成熟，但从心脏、肝脏等实体器官中分离 sEV 却面临巨大挑战 —— 传统方法因需破坏细胞外基质释放 sEV，常导致细胞破损，使分离物被细胞内囊泡、细胞碎片等污染物 “入侵”，严重影响后续分子表征和功能研究的准确性。如何在温和条件下高效释放并纯化组织来源的 sEV，成为领域内亟待突破的瓶颈。
为攻克这一难题，南方科技大学的研究人员聚焦心脏和肝脏组织，开展了一项极具创新性的研究。他们开发出一种温和且高效的 sEV 分离新方法，并对其分离效果进行了系统评估。该研究成果发表在《Extracellular Vesicle》，为实体组织 sEV 的研究开辟了新路径。
研究人员采用的关键技术方法包括：首先，利用组织特异性缓冲液（肝脏使用 HEPES 缓冲液，心脏使用含 BDM 和牛磺酸的缓冲液）保护细胞活性；其次，通过温和酶消化法，肝脏组织选用 Ⅰ 型胶原酶，心脏组织选用 Ⅱ 型胶原酶，结合 DNase I 减少细胞和碎片聚集；随后依次进行差速离心（500×g、2000×g、12000×g）去除细胞、细胞 debris 和大细胞外囊泡（lEV）；再通过超速离心（120,000×g）收集粗制 sEV；最后利用碘克沙醇密度梯度超速离心进行高分辨率纯化，获取不同密度的 sEV 亚群。研究中还运用动态光散射（DLS）、电阻脉冲传感（RPS）、纳米颗粒跟踪分析（NTA）、透射电子显微镜（TEM）和免疫印迹等技术对 sEV 的物理和生化特性进行全面表征。
3.1 肝、心 sEV 的物理特性
通过多种技术检测发现，肝脏 sEV（LiverEV）、心脏 sEV（HeartEV）和血浆 sEV（PlasmaEV）的直径范围在不同检测方法下呈现差异。RPS 和 TEM 显示其主峰在 58-62 nm，符合 sEV 尺寸定义（<200 nm），但 DLS 因原理限制存在高估现象。肝脏和心脏 sEV 的尺寸分布较血浆 sEV 更宽，且 sEV 浓度在不同组织来源中存在差异，肝脏组织的 sEV 浓度最高（达 1012 particles/g）。TEM 证实了 sEV 的杯状形态和膜完整性。
3.2 肝、心 sEV 的生化特性
免疫印迹分析显示，外泌体标志物 CD9、CD63、CD81 和 TSG-101 主要分布在密度 1.050-1.124 g/mL 的 fractions 2-7 中，但不同来源的 sEV 亚群标志物分布存在差异。例如，CD63 在肝脏和心脏 sEV 的高密度 fractions（1.093-1.124 g/mL）中表达，而在血浆 sEV 的低密度 fractions（1.050-1.082 g/mL）中出现，提示不同组织来源的 sEV 亚群具有独特的蛋白标志物特征。
3.3 非囊泡颗粒污染评估
通过 Triton X-100 处理破坏囊泡膜后，NTA 检测显示肝脏和心脏 sEV 中的非囊泡颗粒污染率较低（fractions 3-4 和 5-7 中均 > 90% 为囊泡），血浆 sEV 的污染率约 80%，表明该方法能有效减少非囊泡颗粒的干扰。
3.4 细胞内蛋白污染评估
免疫印迹检测细胞内细胞器标志物（如线粒体 ATP5A、内质网 Calnexin、核 Lamin A/C）发现，血浆 sEV 中这些标志物的存在可能与 sEV 生物发生过程中携带相关蛋白有关，而肝脏 sEV 的高密度 fractions 中存在较多此类标志物，提示可能存在部分细胞内囊泡共纯化现象。但与传统方法相比，该优化方法显著降低了细胞内蛋白的污染水平，同时保持了 sEV 标志物的稳定表达。
研究结论与讨论
该研究开发的温和分离方法通过组织特异性缓冲液、温和酶消化和密度梯度离心的组合，成功从心脏和肝脏组织中分离出高纯度 sEV，显著减少了细胞内囊泡和非囊泡颗粒的污染。研究首次直接比较了血浆与组织来源 sEV 的物理、生化特性，发现它们在形态、尺寸上相似，但密度和蛋白标志物分布存在差异，揭示了组织特异性 sEV 亚群的独特性。这一方法为深入研究生理和病理条件下组织来源 sEV 的功能提供了可靠的技术支撑，有助于推动 sEV 在疾病诊断、治疗等领域的应用。尽管该方法仍存在脂蛋白共沉淀、产量较低等局限性，但其创新性和实用性为实体组织 sEV 研究奠定了重要基础，有望开启细胞外囊泡研究的新维度。
