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本文聚焦微小 RNA（miRNAs）和细胞外囊泡（EVs）。miRNAs 在基因表达调控中意义重大，但临床应用受限。EVs 作为天然载体，可保护并精准递送 miRNAs。文章深入探讨二者联合治疗的优势、挑战、临床进展等，为相关研究提供全面参考。
1. 引言
从青霉素的发现到 mRNA 疫苗的研制，诺贝尔医学奖见证了众多重塑医疗保健的重大进展。2024 年诺贝尔生理学或医学奖授予 Victor Ambros 和 Gary Ruvkun，以表彰他们在微小 RNA（miRNA）研究领域的开创性工作。
在 20 世纪 90 年代前，基因调控的认知主要局限于 DNA 转录为 mRNA 及 mRNA 翻译为蛋白质的过程。Ambros 和 Ruvkun 在研究线虫（C. elegans）发育时，发现 lin-4 基因对 lin-14 的负调控作用，随后 Ambros 发现 lin-4 产生的非编码 RNA 序列（即 miRNA），Ruvkun 则揭示该序列通过与 lin-14 的 mRNA 互补结合发挥抑制作用 。之后，Ruvkun 实验室发现的 let-7 基因编码的 miRNA 在物种间高度保守，这一系列发现为 miRNA 研究奠定了基础，也重新定义了 RNA 在蛋白质合成之外的重要作用。
miRNA 不仅在基因调控中至关重要，还在细胞功能调节和疾病治疗方面展现出巨大潜力。然而，miRNA 在循环系统中不稳定，易被降解，导致其治疗潜力难以充分发挥，因此需要有效的递送机制。细胞外囊泡（EV）作为 miRNA 的天然载体，能够保护 miRNA 并实现精准递送，为解决这一难题带来了希望，二者的协同作用有望开创精准医学的新局面。
2. 微小 RNA：细胞功能和疾病的调节因子
2.1 miRNA 的作用机制
miRNA 在基因表达的转录后调控中扮演关键角色，主要通过调节 mRNA 的稳定性和翻译过程发挥作用。其生物合成始于 RNA 聚合酶 II 转录初级 miRNA（pri-miRNA），pri-miRNA 在细胞核内被切割为前体 miRNA（pre-miRNA） 。pre-miRNA 进入细胞质后，进一步加工为成熟的约 22 个核苷酸的 miRNA，并加载到 RNA 诱导沉默复合体（RISC）中。RISC 携带 miRNA 识别并结合靶 mRNA 的 3' 非翻译区（3' UTR）互补序列，从而抑制或降解靶 mRNA，调控翻译过程，影响细胞从发育到疾病进展等多种重要功能。
2.2 疾病背景下的重要性
miRNA 在多种疾病的发生和发展进程中起着关键作用，它参与调节细胞生长、分化和凋亡等重要生物学过程，与癌症、心血管疾病和神经退行性疾病等多种病症的发病机制密切相关，这也使其成为极具前景的治疗靶点。
在癌症领域，癌细胞中过表达的 miRNA，如 miR-21、let-7 和 miR-34 等致癌 miRNA（oncomiRs），在肿瘤进展和转移中发挥重要作用 。靶向这些 miRNA 的抑制剂有望抑制肿瘤生长。相反，恢复在癌症中常因基因组不稳定而缺失的肿瘤抑制性 miRNA，如 miR-15a/miR-16-1 簇，可激活细胞凋亡和生长调节通路 。
在心血管疾病方面，心脏特异性 miRNA（myoMiRs）对维持心脏健康至关重要。例如，急性心肌梗死（MI）后，心脏中丰度较高的 miR-133 和 miR-1 表达下调，二者均参与心肌肥大的发病过程，通过靶向治疗调节其表达，有可能减轻心脏损伤 。
在神经退行性疾病中，miRNA 同样发挥着多样的作用。在阿尔茨海默病中，miR-9 和 miR-125b 等 miRNA 的缺失与神经炎症和神经元存活受损有关；在帕金森病中，miRNA 参与调节 α- 突触核蛋白，调节这些 miRNA 有望减轻氧化应激和神经元细胞死亡 。由于 miRNA 能够同时调节多个基因和信号通路，对于治疗复杂疾病具有重要意义。
2.3 miRNA 药物开发面临的挑战
鉴于 miRNA 在多种疾病中的异常调控，其作为治疗靶点受到广泛关注。然而，miRNA 在血液中极易被核糖核酸酶（RNases）降解，稳定性差，严重限制了其生物利用度和治疗效果。为提高 miRNA 稳定性，研究人员尝试了多种化学修饰方法，如 2'-O - 甲基化、2'- 氟修饰和引入锁定核酸（LNAs）等 。但这些修饰可能会影响 miRNA 与靶标的结合亲和力，或干扰细胞摄取，降低治疗效果。因此，研究人员通过选择性修饰非关键核苷酸，在增强稳定性的同时维持与靶标的相互作用 。此外，将 miRNA 封装在纳米颗粒等载体中也是一种策略，其中 EV 作为天然载体，不仅能保护 miRNA 免受降解，还能实现靶向递送，为 miRNA 药物开发提供了新方向。
3. 细胞外囊泡：微小 RNA 的天然载体
3.1 EV 的概述及其类型
EV 是细胞自然分泌的由脂质双分子层包裹的颗粒，在细胞间通讯中发挥重要作用，是天然的生物载体。它能够运输包括 miRNA 在内的多种分子货物至受体细胞，影响多种生理和病理过程 。根据其形成机制和大小，EV 可分为外泌体（30 - 150nm）、微囊泡（100 - 1000nm）和凋亡小体（500 - 2000nm）。外泌体由多泡体融合形成，是理想的 miRNA 递送载体；微囊泡在细胞应激时从质膜出芽产生；凋亡小体则在细胞程序性死亡过程中释放。近年来，还发现了如肿瘤小体和迁移小体等新的 EV 亚类，它们在生物发生、大小和功能上各具特点，进一步丰富了人们对 EV 的认识 。
3.2 EV 介导 miRNA 递送的机制
细胞进化出了特定机制，通过 EV 将 miRNA 选择性地加载并靶向递送至受体细胞。内体分选转运复合体（ESCRT）途径在这一过程中起着关键作用，它促进多泡体的形成，miRNA 在 EV 释放前被加载到多泡体中 。其中，ESCRT-II 形成的细丝可促进膜弯曲，并切断外泌体与细胞膜的连接。除了 ESCRT 依赖途径，还存在 ESCRT 非依赖机制，通过特定的基序或相关蛋白对 miRNA 进行分选。例如，hnRNPA2B1 基序可调控特定 miRNA 亚群加载到外泌体中，Y-box 1 蛋白则与 miRNA 结合，参与分选过程，使 EV 富含调节细胞分选、生物发生和靶向的蛋白质 。
EV 的结构特性对 miRNA 在运输过程中的稳定性至关重要。其磷脂双分子层作为物理屏障，能够抵御循环中威胁裸露 miRNA 的 RNases 的降解 。EV 膜富含鞘脂、胆固醇和四跨膜蛋白等，增强了膜的稳定性，保护 miRNA 免受氧化应激、免疫检测和过早降解 。miRNA 被摄取后，先存储在多泡体内，随后直接释放到靶细胞中，避免了在循环中的暴露，降低了降解风险 。此外，EV 相关蛋白如 Argonaute 2（AGO2）和 Y 盒蛋白 1（YB1）可选择性地稳定 miRNA，延长其寿命 。这些因素使得 miRNA 在细胞外环境中能够保持完整，持续数小时甚至数天，使 EV 成为基于 miRNA 疗法的理想载体。
EV 表面含有多种蛋白质和脂质，如整合素（如 αvβ3、αvβ5）、四跨膜蛋白（CD9、CD63、CD81）、磷脂酰丝氨酸和神经酰胺等，这些分子能够与靶细胞上的受体，如硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和凝集素相互作用，实现对特定细胞（包括肿瘤细胞）的精准靶向 。同时，EV 具有组织特异性趋向性，能够根据表面标记和信号分子优先靶向特定组织。例如，间充质干细胞（MSCs）来源的 EV 具有向炎症或受损组织归巢的能力，而内皮祖细胞来源的 EV 则自然积累在缺血组织中 。这种靶向递送特性不仅增强了 miRNA 的治疗潜力，还揭示了 EV 介导的运输与细胞内信号通路调节之间的复杂关系，对细胞功能和疾病发展产生重要影响。
4. 利用 EV 进行治疗性 miRNA 递送
4.1 EV 作为天然递送载体
基于细胞的干预疗法在组织修复和再生领域展现出一定潜力，如静脉注射治疗脑损伤、心脏球移植治疗心肌梗死等 。然而，细胞疗法存在肿瘤发生和免疫排斥等风险，受到美国食品药品监督管理局（FDA）的严格监管，限制了其应用。研究表明，干细胞分泌的细胞外囊泡（常称为天然 EV，na?ve EVs），因其未修饰的特性，可作为一种更安全的无细胞替代方案，递送 miRNA 调节细胞功能，避免了全细胞疗法的复杂性 。
EV 可来源于多种细胞群体，其中干细胞及其子代细胞，如 MSCs、胚胎干细胞（ESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs）备受关注，它们具有独特的再生和免疫调节潜力。例如，iPSC 来源的神经干细胞分泌的 EV 含有 miR-320a、miR-103a-3p 和 miR-21-5p 等 miRNA，能够促进神经发生 ；iPSC 来源的心肌细胞分泌的 EV 富含 miR-1 和 miR-133a，与水凝胶贴片结合使用，可显著减小心肌损伤模型中的梗死面积 。富含 miRNA 的干细胞来源的 EV 为再生医学开辟了新途径，避免了使用全细胞带来的风险。
虽然天然来源的 EV 为 miRNA 递送提供了安全、生物相容性好的选择，但对其进行工程改造能够进一步提高治疗的精准性。通过表面修饰，如添加心脏归巢肽，可使 EV 实现靶向递送，在心肌梗死模型中已得到验证 。与合成纳米颗粒相比，EV 能够更有效地穿越生物屏障，逃避免疫检测，具有更好的治疗性能 。
多种加载技术的发展推动了 EV 作为治疗性 miRNA 载体的应用，通过 miRNA 抑制剂和模拟物实现靶向基因沉默或激活 。被动加载方法，如孵育和冻融循环，操作简单，如研究中使用 EV 递送紫杉醇治疗前列腺癌 。但其加载效率较低，约为 5% 。主动加载方法，如电穿孔和超声处理，可诱导 EV 膜形成临时孔隙，提高 miRNA 的加载效率。电穿孔的加载效率通常小于 10%，不过优化后的方案可将效率提高至 30% 。此外，通过对亲本细胞进行基因改造，使其产生富含 miRNA 的 EV，可实现持续的治疗效果。例如，过表达 miRNA-let-7c 的 MSC 来源的 EV 在减轻肾纤维化方面表现出显著疗效 。转染方法的加载效率较高，可超过 50% 。尽管这些方法在递送后显示出明显的功能效果，但仍需不断改进加载技术和提高效率，以充分发挥基于 EV 的 miRNA 递送的治疗潜力。
4.2 EV 递送系统的局限性
尽管 EV 能够增强 miRNA 的稳定性，但基于 EV 的递送系统在临床转化过程中仍面临诸多挑战。EV 群体存在固有的异质性，在大小、分子组成和功能特性等方面存在差异，这可能导致治疗效果的不一致性，因此需要优化 EV 的分离和表征方案 。先进的分析技术，如高分辨率流式细胞术和质谱技术，可用于精确识别 EV 亚群和分析其携带的货物。成像流式细胞术能够根据大小和表面标记区分 EV 亚群，而基于质谱的蛋白质组学和脂质组学则可提供全面的分子特征，有助于降低 EV 的异质性 。
为将这些分析技术应用于实际，优化分离技术对提高基于 EV 疗法的可重复性和可靠性至关重要。尺寸排阻色谱（SEC）、不对称流动场 - 流分离（AF4）和切向流过滤（TFF）等分离策略在提高 EV 纯度和可扩展性、降低批次间差异方面已显示出一定效果 。此外，标准化生产方法，如超速离心和沉淀法，对于确保符合监管要求、实现大规模生产也至关重要 。
建立严格的质量分析和控制指标是 EV 疗法临床应用的基础。虽然四跨膜蛋白常作为 EV 的常规标记物，但粒子与蛋白质的比例、RNA 含量、zeta 电位和刚性等参数可进一步提高 EV 生产的可重复性 。此外，维持高质量的细胞培养、确保分离的 EV 纯度、标准化分离方法以及评估包装安全性等都是关键的质量控制措施 。近期，通过分析 MSC 的形态来预测其分泌的 EV 的抗炎活性，将质量控制融入 EV 工程的研究也取得了一定进展 。严格的质量评估对于确保基于 EV 疗法的一致性、安全性和获得监管批准至关重要。
5. miRNA - 基于 EV 疗法的商业化
5.1 有前景的临床前和临床试验
近期的临床试验将基于 EV 的 miRNA 疗法作为治疗复杂疾病的新型治疗平台进行研究。尽管目前许多 miRNA 疗法试验依赖脂质体或直接注射，但基于 EV 的试验主要聚焦于递送蛋白质和药物等大分子，进入临床试验的外泌体 miRNA 疗法数量有限，进入 3 期试验的更是稀少 。
2014 年进行的一项 2/3 期临床试验，使用脐带来源的 MSC EV 治疗慢性肾病（CKD）。40 名患有 III 期和 IV 期 CKD 的患者分别接受 EV 或安慰剂治疗，并监测肾功能和免疫活性。结果显示，接受 MSC EV 治疗的患者肾小球滤过率改善，血浆中 TGF-β 和 IL-10 水平升高，证明了天然含 miRNA 的 EV 的治疗潜力 。另一项 1 期试验研究了富含 miR-169 的葡萄来源外泌体对接受化疗和放疗的癌症患者口腔粘膜炎的缓解作用。每日给予这些 EV 显示出显著的抗炎效果，突出了植物来源 EV 在治疗中的前景 。此外，一项正在进行的 3 期试验正在评估骨髓 MSC 来源的 EV 对急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的治疗效果。患者口服 EV 60 天，评估生存时间和无呼吸机天数等指标，预计 2025 年初公布结果，有望进一步验证 MSC 来源的 EV 对 ARDS 的治疗作用 。
然而，一些基于 EV 的 miRNA 疗法试验被终止、撤回或目前状态不明 。这些问题部分源于安全性和有效性担忧，也与符合条件的参与者不足、公司破产或项目优先级调整等因素有关 。由于 EV 研究仍处于新兴阶段，在受试者招募和资金获取方面面临挑战。因此，提高科学界和潜在投资者的认识，对于支持这一变革性技术的发展至关重要。这些试验的有限成功凸显了持续研发的必要性，以克服现有障碍，提高基于 EV 的 miRNA 疗法的有效性，并争取更多支持。
5.2 当前的商业和治疗努力
近年来，miRNA 和 EV 的交叉领域受到广泛关注，相关出版物数量众多，且有 25 项正在进行的临床试验 。外泌体市场预计在 2024 年至 2030 年将以 28.38% 的复合年增长率增长，miRNA 市场目前估值为 128.7 亿美元 。尽管如此，目前尚无 FDA 批准的基于 miRNA 的 EV 药物递送商业产品。为提高 EV 研究的市场转化率，改进临床试验设计和 EV 技术至关重要。例如，根据生物标志物谱对患者进行分层，有助于确定最可能从基于 miRNA 的 EV 疗法中获益的人群 。此外，优化 EV 工程，如提高 miRNA 加载效率、增强靶向递送能力和改进大规模生产技术，可提高治疗的精准性和一致性，促进临床转化和商业化。
多家公司在不同疾病领域开展了基于 miRNA 和 EV 的治疗产品研发（见相关表格），研发重点主要集中在开发高效的纯化方法、增强组织特异性靶向能力以及创建可定制的 EV 平台以实现有效载荷加载。
5.3 安全性和有效性问题
由于 miRNA 可影响众多基因的表达，基于 EV 的 miRNA 疗法存在脱靶效应风险，可能导致关键细胞过程的意外基因调控。为降低这种风险，研究人员探索通过工程改造使 EV 携带特定靶向受体，引导其到达目标细胞或组织 。然而，由于 EV 表面蛋白与细胞受体之间的复杂相互作用尚未完全明晰，实现可靠的靶向仍面临挑战。这种认知不足也影响了机体对 EV 的免疫反应，部分研究表明，EV 的来源和递送方式可能引发炎症反应 。因此，深入研究 EV 表面蛋白，有助于减少脱靶效应和免疫激活，提高外泌体 miRNA 疗法的安全性和有效性。此外，优化实验模型，如利用类器官系统和人源化动物模型，可更好地模拟人体生理条件，深入了解 EV 的生物分布、意外基因相互作用和免疫反应，从而实现更精准的治疗设计，减少临床应用中的脱靶效应。
EV 的复杂性质给监管带来了重大挑战，美国 FDA 和欧洲 EMA 等机构致力于将基于 EV 的 miRNA 疗法纳入现有监管框架。尽管存在困难，但由于外泌体成分相对简单，免疫排斥风险较低，预计其审批过程会比细胞疗法更为顺利 。2019 年，FDA 宣布将用于人类疾病治疗的外泌体归类为药物和生物制品 。然而，EV 生产缺乏标准化的质量控制措施，仍然阻碍着临床试验的进展和实验室成果的转化。2023 年 1 月，FDA 开始着手为 MSC 来源的 EV 建立特定的控制参数，但对于其他细胞来源的 EV，在走向临床批准前仍需进行广泛的特性表征 。建立明确的监管指南和标准化协议，对于确保基于 EV 疗法的一致性、安全性和有效性至关重要，有助于优化临床试验设计，加速其市场化
