1. 细胞外囊泡（EVs）概述
1.1 EVs 的基本特性
细胞外囊泡（EVs）是细胞在稳态和病理条件下分泌的双层磷脂纳米颗粒。它能携带蛋白质、脂质、核酸（DNA、RNA，如 mRNA、微小 RNA（miRNA）、长链非编码 RNA（lncRNA））等生物活性物质，其组成受母细胞类型和生理微环境影响。
根据大小和生物发生过程，EVs 常被分为小 EVs（曾称外泌体）、大 EVs（曾称胞外体）和凋亡小泡（apoVs）。小 EVs 直径小于 200nm，多通过外泌体途径产生；大 EVs 直径大于 200nm，由细胞膜直接向外出芽或缢裂形成；apoVs 由死亡细胞释放，大小差异大，直径在 50 - 5000nm 之间。
EVs 在细胞运动、分化、增殖、凋亡、重编程和免疫等生物过程中发挥重要作用。例如，干细胞来源的 EVs 可促进组织再生，树突状细胞和巨噬细胞来源的 EVs 能调节免疫反应；而癌细胞来源的 EVs 则有助于肿瘤转移，不过不同细胞来源的 EVs 在治疗感染性疾病、糖尿病、肿瘤、神经退行性疾病和心血管疾病方面展现出潜力。
1.2 EVs 的分离与鉴定
由于 EVs 分子和结构的异质性，其研究面临挑战。国际细胞外囊泡协会（ISEV）发布了相关研究建议（MISEV2023），涵盖 EVs 的分离、鉴定、应用及研究报告等方面。
目前，从生物流体和细胞培养基等不同来源富集和纯化 EVs 的技术多样，包括超速离心（UC）、梯度超速离心、共沉淀、尺寸排阻色谱（SEC）、场流分级分离和亲和捕获等，但尚无金标准，常用方法为 UC、SEC 或二者结合。
鉴定 EVs 时，需对分离物进行生物物理表征并识别 EVs 标记物。EVs 样本应至少有一种跨膜 / 脂质结合蛋白（如 CD63、CD81、CD9）和一种细胞质蛋白（如 TSG101、Annexin V、ALIX）呈阳性，且非囊泡细胞外颗粒呈阴性。此外，还可通过电子显微镜（EM）、原子力显微镜（AFM）等成像方法观察 EVs，利用纳米颗粒跟踪分析（NTA）、动态光散射（DLS）等技术测量其数量和浓度，也可借助蛋白质分析和单囊泡成像平台进行精确识别和分类。
1.3 EVs 的来源
EVs 来源广泛，可分为常规 EVs（源于人类或动物）和非常规 EVs（来自细菌、真菌、寄生虫或植物）。常规 EVs 可从血液、唾液、尿液等多种体液中分离，也可从培养的不同细胞类型（如干细胞、树突状细胞、巨噬细胞等）的条件培养基中获取。当前，利用细胞来源的 EVs 作为治疗手段备受关注，但在转化应用前，需解决细胞来源、培养方法、细胞状态、生长条件及可扩展性等问题。
非常规 EVs 中，细菌和微藻来源的 EVs 易于大量生产，植物来源的 EVs 可从水果、蔬菜和植物细胞中分离，成本效益高。如姜来源的类似 EVs 颗粒含 miRNA，能抑制感染 SARS-CoV2 小鼠肺组织中促炎细胞因子的表达，但非传统 EVs 作为治疗替代品的潜力仍需进一步研究。本文主要关注常规 EVs 的生物学作用和治疗用途。
1.4 EVs 与细胞信号传导
EVs 的分子组成包含多种蛋白质、脂质和核酸，这些成分可在亲代细胞和受体细胞间转移，介导细胞间通讯和分子传递。其组成因亲代细胞类型和条件而异，决定了 EVs 的功能。
EVs 可作为信号复合物，通过转移膜受体、传递蛋白质和遗传物质来调节受体细胞。细胞间通讯涉及细胞靶向、EVs 与受体细胞融合、货物释放和分子信号传递等过程，且受 EVs 组成、细胞环境（如细胞外基质和其他微环境因素）以及亲代和受体细胞的类型、状态和表面化合物影响。受体细胞摄取 EVs 的途径多样，包括网格蛋白依赖的内吞作用、小窝蛋白介导的摄取、巨胞饮作用、吞噬作用和脂筏介导的内化等。EVs 介导的旁分泌和自分泌信号传导，可能通过 EVs 表面分子与靶细胞受体直接相互作用，或在 EVs 货物内化后间接调节细胞通路。EVs 在炎症、免疫信号传导、凝血、血管反应性、血管生成和组织修复等生理过程中发挥重要作用，也与癌症、神经退行性疾病、心血管疾病和感染等多种疾病的病理过程相关，其作用通常涉及特定的信号通路，且具有上下文依赖性。
2. EVs 在慢性炎症性疾病模型中的作用
慢性炎症可诱导组织和器官发生病理变化，是多种疾病的关键驱动因素。组织 EVs 在炎症性疾病的发病机制中起重要作用，既能调节局部免疫反应、传播炎症信号、转移致病因素，导致炎症持续，也能通过抑制炎症、增加抗炎因子、保护靶细胞免于凋亡和减少疾病相关蛋白表达等方式参与生理过程。此外，干细胞来源的 EVs，如间充质干细胞（MSCs）和诱导多能干细胞（iPSCs）来源的 EVs，因其具有抗炎和再生特性，有望成为慢性炎症性疾病的新型治疗方法。
2.1 骨关节炎
骨关节炎（OA）是一种常见的慢性退行性关节疾病，是全球致残的主要原因之一。其特征为滑膜炎症、进行性软骨降解和软骨下骨重塑，导致关节疼痛、畸形和功能障碍。多种细胞因素和病理生理条件参与 OA 的发生发展，其中关节组织稳态失衡是关键因素，OA 相关免疫细胞产生的促炎介质会加剧软骨降解。
EVs 在 OA 发病机制中扮演重要角色。滑膜液中分离的 EVs 数量和货物含量可作为 OA 严重程度的指标，病情越严重，EVs 浓度越高，且含有更多与免疫系统相关的肽。人滑膜样成纤维细胞来源的 EVs 可在体外和体内模型中诱导 OA 样变化，如上调关节软骨细胞中基质金属蛋白酶（MMP）-13 和含血小板反应蛋白基序的解聚素和金属蛋白酶 5（ADAMTS-5）的表达，下调编码关键软骨基质成分的 COL2A1 和 ACAN 基因表达。软骨下骨成骨细胞分泌的含 miR-210-5p 的小 EVs，可增加软骨细胞中 MMP-13 和 ADAMTS-5 的表达，降低 SOX9 和 COL2 等软骨形成因子的表达，促进 OA 发病。
2.1.1 EV 疗法在 OA 中的应用
传统 OA 治疗方法主要侧重于缓解症状，对阻止或逆转关节组织（如软骨和软骨下骨）破坏的效果有限。自体条件血清疗法利用 IL-1 受体拮抗剂，借助血清的天然愈合特性促进组织修复、调节炎症和增强免疫功能，是 OA 的潜在治疗途径，但临床疗效存在争议。研究发现，这些产品中含有丰富的血液来源 EVs，提示其可能是 OA 治疗的关键成分。血液来源的 EVs 含有功能性线粒体和低水平致病细胞因子，具有抗炎特性，可诱导软骨保护基因表达。
随着再生医学的发展，干细胞疗法用于 OA 组织修复的研究不断深入，MSCs 因其自我更新、分化和免疫调节能力展现出良好前景。与直接移植外源性 MSCs（细胞疗法）相比，EVs 具有非增殖、非免疫原性、易于储存和运输的优势，还可避免干细胞治疗中存在的存活率低、体内分化不可控等问题。
多项研究表明，MSCs 来源的 EVs（MCS-EVs）在 OA 治疗中对缓解疼痛、抑制炎症、免疫调节和促进软骨组织再生具有显著效果。不同来源的 MSCs，如骨髓、脂肪组织、脐带、滑膜膜 / 液、胚胎干细胞和 iPSCs 来源的 MSCs，均可产生具有治疗潜力的 EVs。例如，脂肪来源的 MSCs（hAD-MSCs）衍生的 EVs 可减少炎症介质产生，增加抗炎细胞因子 IL-10 和软骨基质成分 II 型胶原（COL II）的表达；骨髓来源的 MSCs（BM-MSCs）衍生的 EVs 可调节多种细胞行为和生理病理过程，促进受损关节组织修复；人脐带 MSCs（hUC-MSCs）衍生的 EVs 能增强软骨细胞和 BM-MSCs 的迁移、增殖和分化能力。
此外，其他细胞来源的 EVs 也具有治疗 OA 的潜力。如原代软骨细胞来源的 EVs 可改善线粒体功能障碍，使巨噬细胞向 M2 表型极化；M2 巨噬细胞来源的 EVs 可减少 OA 大鼠的炎症反应和关节软骨病理损伤；成纤维样滑膜来源的 EVs 可增强软骨细胞活力和迁移能力，减轻基质降解。
为进一步提高 EVs 治疗 OA 的效果，研究人员对其进行工程化改造。通过定制 EVs 调节 miRNA 表达，可更精准地改善疾病特征，如抑制炎症和细胞凋亡、调节软骨细胞增殖和迁移、促进软骨细胞基质分泌等。工程化 EVs 还可靶向特定细胞类型或包含所需分子，减少脱靶效应，降低治疗剂量和成本。例如，将软骨细胞亲和肽（CAP）与溶酶体相关膜糖蛋白 2b 结合到软骨细胞靶向 EVs 表面，可有效抑制软骨降解蛋白酶，减缓 OA 进展；将外源性 miR-223 加载到 hUC-MSC EVs 中，并修饰其表面蛋白冠，可增强对 NLRP3 炎性小体激活和软骨细胞焦亡的抑制作用。
同时，对 MSCs 进行刺激或预处理后获得的 EVs 在 OA 治疗中效果更佳。如缺氧刺激 MSCs 获得的 EVs 可通过调节 miR-216a 5p/JAK2/STAT3 信号通路，增强软骨细胞的增殖、迁移和抗凋亡能力；TGF-β3 预处理 BM-MSCs 获得的 EVs 富含 miR-455，可通过激活 SOX11/FOXO 信号通路缓解 OA 发展，促进软骨再生。
尽管 EVs 在 OA 治疗中展现出巨大潜力，但仍面临一些挑战。OA 是一种全关节疾病，可能需要大量且重复给药才能产生长期治疗效果，目前 EVs 的大规模生产存在困难。此外，EVs 在 OA 关节内的生物分布、药代动力学和特异性尚不确定，可能影响治疗效果，阻碍其临床转化。未来需通过技术创新和改进临床前模型来克服这些限制。
2.2 心血管疾病（CVD）
心血管疾病（CVD）包括多种影响心脏和血管系统的疾病，是全球主要死因，如冠心病、高血压、脑血管疾病等，可导致中风、心肌梗死（MI）等严重后果。CVD 的发展受遗传和多种可改变的风险因素影响，部分患者无症状，诊断困难。尽管现有多种治疗方法，但全球 CVD 死亡率仍较高。近年来研究发现，EVs 在 CVD 发病机制中起重要作用，并为治疗提供了新契机。
2.2.1 EVs 与心肌梗死
在心脏中，EVs 对维持细胞通讯至关重要，组织损伤或受伤后其产生显著增加。心肌梗死（MI）时，心脏遭受缺氧应激，导致心肌细胞严重损伤，心肌细胞凋亡会诱导心脏成纤维细胞增殖，进而影响心脏重塑和功能。小鼠冠状动脉结扎后，左心室释放的 EVs 在结扎后 15 和 24 小时显著增加，其中心肌细胞和内皮细胞来源的 EVs 占比较大。
循环中的 miRNAs 常被用作心脏疾病的生物标志物，且通过 EVs 在全身循环中运输。例如，循环 miR-21 与心脏纤维化和肥大的发展相关，可作为心力衰竭死亡率和再住院的有效生物标志物。心脏成纤维细胞来源的 EVs 中 miR-21 表达显著高于亲代细胞，且在血管紧张素 II 刺激下进一步增加。当心肌细胞暴露于去除 EVs 的心脏成纤维细胞培养基中时，肥大效应减弱。此外，梗死心肌细胞释放的 EVs 含有 miR-328-3p，可诱导健康心肌细胞凋亡，激活 caspase-3 通路。这些研究表明，EVs 在 MI 后心肌细胞死亡、心脏重塑和纤维化发展中起重要作用。
相反，干细胞来源的 EVs 可促进 MI 后心脏恢复。将心脏祖细胞来源的 EVs 经心肌内注射给予实验性 MI 再灌注猪，可显著改善左心室功能，减小梗死面积，减少瘢痕大小和质量，降低心脏纤维化面积。此前研究也发现，MSCs 来源的 EVs 携带血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子 2 和肝细胞生长因子等旁分泌因子，有助于 MSCs 治疗 MI 模型的成功。
2.2.2 EVs 与动脉粥样硬化
动脉粥样硬化是一种慢性低度炎症性疾病，以内皮损伤为特征，可导致动脉内脂质丰富的斑块逐渐形成。斑块破裂可能引发缺血性心脏病发作、中风或阻塞血流。循环内皮细胞（EC）来源的 EVs 数量会随着心血管危险因素（如代谢综合征、血脂异常）增加，可能是内皮损伤和 EC 凋亡的结果。刺激后的 EC 及其来源的 EVs 可携带超氧化物，显著损害血管功能，尤其是内皮功能。高糖处理的人冠状动脉 EC 来源的 EVs 给予动脉粥样硬化小鼠后，可导致内皮功能受损，巨噬细胞募集增加，活性氧（ROS）生成增多，提示糖尿病条件下产生的 EVs 可能促进动脉粥样硬化发展。
内皮祖细胞（EPCs）是具有与血管内皮相似表面标记的循环细胞，在内皮损伤时可黏附到血管并参与新血管形成。EPCs 来源的 EVs 注射到糖尿病动脉粥样硬化小鼠体内，可降低血管氧化应激、炎症和动脉粥样硬化程度。EPCs 来源的 EVs 含有多种 miRNAs，可促进血管生成和调节炎症。例如，miR-199a-3p 在动脉粥样硬化小鼠血清中水平降低，与促炎细胞因子 IL-6 水平升高和病变覆盖面积增大相关，而 EPCs 来源的 EVs 中 miR-199a-3p 表达增加，可减少平滑肌细胞增殖和迁移、EC 铁死亡和内皮损伤，从而预防或减缓动脉粥样硬化发生。
2.2.3 EVs 与缺血性中风
中风是 CVD 的严重后果，死亡率高，约 20% 的缺血性中风由颈动脉斑块破裂引起。脑部血流中断会导致缺氧和局部葡萄糖供应不足，引发广泛的神经元损伤和凋亡，可能导致严重的身体残疾或死亡。缺血性中风后，EC-EVs 数量显著增加，可能是半暗带内 EC 凋亡和炎症的结果，其增加可作为中风严重程度的潜在生物标志物。
在小鼠缺血性中风模型中，经尾静脉注射的 MSCs-EVs 可归巢到脑缺血损伤部位，减轻炎症标记物水平，促进神经再生和血管生成。在短暂性脑缺血发作患者中，循环 EVs 数量比健康对照增加，且许多 EVs 来源于血小板，这些 EVs 携带的特定抗原可作为预测患者是否发生真正缺血性中风及中风严重程度的生物标志物，凸显了 EVs 分析在 CVD 生物标志物发现和疾病预测中的潜在价值。
2.2.4 EVs 作为心血管疾病的治疗手段
与活细胞相比，使用 EVs 治疗 CVD 具有优势，如在体内保留时间长、免疫原性低，可减少给药频率和剂量，降低免疫清除，减轻患者负担。作为一种新型治疗方法，EVs 可被工程化改造为靶向药物递送系统，包裹特定分子或药物。
一项系统综述分析了 28 项临床前研究发现，工程化 EVs 在治疗缺血性中风方面比未修饰的干细胞来源 EVs 效果更好，可减小脑梗死面积，促进行为和神经功能恢复。例如，过表达 miRNA-138-5p 的 BM-MSCs 来源的工程化 EVs，可促进小鼠缺血性中风后的星形胶质细胞增生，减轻炎症反应。
通过电穿孔、超声处理、挤压和反复冻融循环等技术，可修饰 EVs 的货物，增强其治疗 CVD 的功能。如转染促血管生成 miR-322 的心脏祖细胞（CPCs）来源的 EVs，经全身给药后在 MI 小鼠模型中具有显著的心脏保护作用，可减小梗死面积，促进血管生成。转染靶向 Smad 2/3 的小干扰 RNA（siRNA）的 MSCs 和脂肪组织来源的 EVs，可改善动脉粥样硬化小鼠的血管功能，减少血管壁厚度；转染 miR-145 的人 MSCs 来源的 EVs，可通过促进紧密连接抑制单核细胞黏附，减少内皮细胞迁移，显著减缓小鼠动脉粥样硬化发展。
此外，工程化改造 EVs 的表面蛋白可增强其对特定细胞类型的亲和力。如工程化 CPC-EVs 使其过表达 CXCR4，可增加其与基质细胞衍生因子 1α（SDF-1α）的结合。MI 小鼠中，SDF-1α 表达增加可促进过表达 CXCR4 的 CPC-EVs 向梗死区域递送，与未修饰的 CPC-EVs 相比，可显著减小梗死面积，提高射血分数。
目前，评估工程化 EVs 治疗 CVD 的研究有限，但前景广阔。未来研究可通过工程化改造 EVs 的表面蛋白冠，提高其向靶器官的归巢能力，并优化药物装载方案，提高装载效率，减少脱靶效应。
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