鱼类EPC细胞中RIG-I泛素化解码：位点鉴定及其抗病毒机制研究

本研究聚焦硬骨鱼RIG-I样受体(RLRs)泛素化调控机制这一未充分探索领域，通过整合计算预测与实验验证，在鲤鱼上皮瘤细胞(EPC)中鉴定出6个RIG-I泛素化位点(K115/K118/K145/K163/K168/K171)，其中K163/K168/K171在哺乳动物中保守。研究发现K63连接泛素化位点K115/K118/K163通过调控干扰素(IFN)信号通路影响抗病毒反应，特别是K118R突变显著促进鲤春病毒血症病毒(SVCV)增殖，而K115R突变意外增强抗病毒活性。该研究首次揭示硬骨鱼RIG-I多位点泛素化可产生差异抗病毒效果，为理解脊椎动物RLR信号通路进化保守性提供新视角。

　　

在病毒与宿主的进化军备竞赛中，脊椎动物发展出复杂的模式识别受体系统来检测病原体。作为关键的胞质RNA传感器，维甲酸诱导基因I样受体(RIG-I like receptors, RLRs)通过识别病毒RNA触发干扰素(IFN)信号级联反应。尽管哺乳动物中RIG-I泛素化调控机制已被广泛研究，但在硬骨鱼这一脊椎动物重要类群中，其分子机制仍如"暗箱"般未被揭示。尤其令人困惑的是，硬骨鱼虽具备保守的RLR信号通路元件，但其RIG-I是否通过类似哺乳动物的多位点泛素化实现精准免疫调控，成为领域内亟待解决的科学问题。

中国某研究机构团队在《Fish》发表的研究中，选择鲤鱼上皮瘤细胞(EPC)作为模型，结合AlphaFold2结构预测、GraphUbiquSite算法和CRISPR-Cas9基因编辑技术，系统解析了硬骨鱼RIG-I泛素化特征。通过鲤春病毒血症病毒(SVCV)感染实验，研究人员发现K115/K118/K163位点的K63连接泛素化对IFN信号激活具有差异化调控作用，其中K118R突变体导致ifn及ISGs(gig1/mx1/viperin)表达显著下调，而K115R突变却意外增强抗病毒反应。这些发现不仅填补了硬骨鱼先天免疫调控的知识空白，更揭示了泛素化"分子开关"在脊椎动物中的进化保守性与物种特异性。

关键技术方法包括：1)基于深度学习的泛素化位点预测算法；2)EPC^rigi-/-基因敲除细胞系构建；3)定点突变与K63连接泛素化检测；4)SVCV病毒载量定量分析。

细胞和病毒
研究使用EPC细胞系在25°C条件下培养，通过测定SVCV基因组拷贝数与细胞数的比值确定感染复数(MOI)，建立标准化病毒感染模型。

预测的EPC细胞RIG-I泛素化位点
通过多算法整合预测发现，EPC RIG-I的K115/K118/K145/K163/K168/K171位点具有高泛素化倾向，其中K163/K168/K171在哺乳动物直系同源物中保守。AlphaFold2结构模拟显示这些位点分布于2CARD和 helicase结构域的关键功能区域。

讨论
研究证实硬骨鱼RIG-I通过K63连接的多位点泛素化精细调控抗病毒反应，这种"分层调控"模式与哺乳动物存在显著差异：K118而非K163成为核心调控位点，且K115泛素化表现出抑制性功能。特别值得注意的是，K115R突变体通过增强RIG-I自寡聚化产生"超激活"效应，这为设计新型免疫调节剂提供了潜在靶点。

该研究突破性地证明：硬骨鱼RIG-I通过进化保守的K63连接泛素化机制激活IFN信号，但具体位点功能权重发生适应性改变。这种"保守中求变异"的调控策略，可能反映鱼类应对水生病毒压力的独特免疫适应机制。研究建立的"计算预测-实验验证-功能解析"一体化研究范式，为其它非模式生物的免疫调控研究提供了方法论参考。从转化医学视角看，发现K115的自抑制效应为开发靶向RIG-I寡聚化的免疫增强剂开辟了新思路。