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为解决食品原料真实性问题，尤其是开心果在烘焙食品中被非法替代的情况，研究人员开展基于下一代测序（NGS）的 DNA 代谢条形码技术研究。结果显示该技术能识别六种常见掺假物，可半定量分析。这为食品认证提供高效方案。
在美食的世界里，开心果常常被视为高品质的象征，它为各种烘焙食品增添独特的风味和丰富的营养。然而，不法商家为了追求高额利润，常常用廉价的坚果替代昂贵的开心果，这种食品欺诈行为不仅损害了消费者的利益，还可能对食品安全构成威胁。比如在传统的土耳其甜点果仁蜜饼（baklava）中，开心果就经常遭遇被 “调包” 的命运。为了打击这种不良现象，来自汉堡大学（University of Hamburg）的研究人员开展了一项极具意义的研究，相关成果发表在《Food Chemistry: Molecular Sciences》上。
在食品行业，确保食品原料的真实性至关重要，它关乎食品安全、质量控制以及消费者的健康。过去一百多年来，食品成分的欺诈性更改和未申报问题一直存在。食品标签错误不仅是经济问题，还可能引发健康风险，例如未申报的过敏原可能危及过敏人群的生命。在植物和动物产品中，优质品种常被低质品种替代，开心果因其高昂的价格和广泛应用，成为食品欺诈的重灾区。开心果主要产自伊朗、美国（加利福尼亚）、土耳其等气候温暖但水资源有限的地区，其种植需要昂贵的灌溉系统，导致价格高达 36 �/kg 甚至更高。这些因素都促使研究人员寻找一种可靠的方法来检测开心果的掺假情况。
研究人员采用基于下一代测序（Next-generation sequencing，NGS）的 DNA 代谢条形码（DNA metabarcoding）技术进行研究。该技术相比传统的桑格测序（Sanger sequencing），具有数据深度大、效率高的优势，还可用于检测食源微生物等。研究人员选择叶绿体基因组的 mini-rbcL 区域，使用 Illumina MiSeq? 仪器进行测序。
材料与方法
研究使用来自汉堡大学植物科学与微生物研究所的参考样本，包括开心果（Pistacia vera）、核桃（Juglans regia）等七种坚果和种子样本。零售样本用于制备定量控制混合物，商业果仁蜜饼样本则从汉堡的商店收集。DNA 提取采用 Promega 公司的 Maxwell? RSC PureFood GMO 和认证试剂盒，提取后进行浓度测定。从 NCBI 数据库下载相关叶绿体参考基因组，用于引物比对和定制数据库。实验选用多组引物，包括 Mini-rbcL、trnL (P6 loop) 和 ITS2，对样本进行扩增。按照修改后的 Illumina “16 S 宏基因组测序文库制备” 协议进行文库制备和测序，最后使用 APSCALE 管道进行 NGS 数据分析。
结果与讨论
- Mini-rbcL 引物组的优势：对七种参考样本、控制混合物样本和果仁蜜饼样本进行扩增，结果显示 Mini-rbcL 引物组的扩增效果最佳。其扩增子长度约 320bp，能成功区分七种目标物种，且可检测到意料之外的物种，片段大小与常用的 16 S 代谢条形码方法一致，便于联合使用。
- 物种鉴定：对参考样本测序后使用 APSCALE 管道和 NCBI nt 数据库分析，部分样本可在属水平鉴定，如开心果、核桃等，但向日葵（Helianthus annuus）、豌豆（Pisum sativum）和南瓜（Cucurbita spp.）只能鉴定到亚科水平。为此创建两个定制数据库，其中hucustomdb_nuts_2数据库仅包含七种目标坚果物种，使用该数据库可将所有参考样本鉴定到物种水平（部分因信息不足鉴定到属水平）。通过设定比特分数（bit-score）阈值 230 bits，可判断样本是否属于七种坚果物种。
- 优化定量分析：研究制备控制混合物样本，考虑基质效应进行定量分析。结果发现，5% 比例的样本相对偏差较高，如Prunus spp. 的测量值均低于 5%，Pisum spp. 出现假阴性。50% 和 90% 比例的样本结果更接近目标值，但Prunus spp. 仍低于目标值，表明基质效应在不同比例下均存在。因此，代谢条形码定量应作为半定量方法用于估计果仁蜜饼产品中成分的含量。
- 商业果仁蜜饼样本分析：对收集的商业果仁蜜饼样本分析发现，只有来自专业面包店的 B10、B11 和 B12 样本含有纯开心果，其他样本均检测到其他物种，如 Asteroideae、Prunus spp.、Corylus spp. 和 Cucurbitaceae 等，部分样本中这些物种的比例超过 20%，表明食品欺诈在果仁蜜饼样本中并不罕见。
研究人员基于叶绿体基因组的 mini-rbcL 区域开发的 DNA 代谢条形码方法，结合定制数据库，可在属水平识别七种坚果物种，重点是Pistacia spp.。考虑基质效应后，该方法可进行半定量分析。商业果仁蜜饼样本的检测结果表明，开心果产品中的食品欺诈现象需密切监测，且该方法有望应用于其他开心果产品和新型坚果的检测，为保障食品真实性提供了有力的技术支持。
