α-L-岩藻糖苷酶BF3242的半理性工程改造实现高区域选择性合成岩藻糖基-N-乙酰葡糖胺二糖

本研究针对α-L-岩藻糖苷酶(α-L-fucosidases)在转糖基化反应中区域选择性和活性不足的问题，通过整合环靶向随机诱变和定点饱和诱变技术，对源自脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)的BF3242酶进行改造。成功获得双位点突变体L266H/M285T，其Fuc-α-1,3-GlcNAc合成区域选择性提升至98%，总产率达85%，RT/H值较野生型提高2.7倍。分子动力学模拟揭示突变体通过降低loop-4区柔性、增强氢键相互作用实现性能优化，为生物法高效制备具有益生功能的岩藻糖基化寡糖提供了优质催化剂。

　　

在寡糖合成领域，化学合成法面临保护基操作繁琐、反应条件苛刻等挑战，而酶法合成虽绿色环保，却长期受限于糖苷酶的催化性能。特别是α-L-岩藻糖苷酶作为合成岩藻糖基化寡糖的重要工具，其转糖基化活性和区域选择性不足严重制约工业化应用。岩藻糖基-N-乙酰葡糖胺二糖(Fuc-α-1,3-GlcNAc)作为母乳寡糖关键组分，具有促进益生菌生长、抑制致病菌粘附等生理功能，但其高效制备面临重大技术瓶颈。针对这一难题，来自中国的研究团队在《Food Chemistry: Molecular Sciences》发表重要成果，通过对BF3242酶进行系统性改造，成功突破天然酶催化性能限制。

研究采用环靶向随机诱变(MEGAWHOP)、定点饱和诱变结合分子对接等关键技术，以pNPαFuc为糖基供体、GlcNAc为受体，通过HPLC和TLC分析产物组成，并运用GROMACS进行分子动力学模拟阐释分子机制。

【3.1 环靶向诱变筛选高区域选择性突变体】
通过对loop-4区(H242-S267)进行定向进化，发现L266F突变使1,3-区域选择性从69%提升至96%。饱和诱变证实L266H突变体在保持69%总产率的同时实现同等选择性提升，揭示L266是调控区域选择性的关键位点。

【3.2 糖基结合亚位点工程优化转糖基化活性】
分子对接鉴定出G57、E58等五个糖基结合亚位点，其中M285C突变使双突变体L266H/M285C总产率提升至76%。进一步饱和诱变获得最优突变体L266H/M285T，其Fuc-α-1,3-GlcNAc产率达83%（占总产物98%），RT/H值较野生型提高2.7倍。

【3.3 分子动力学揭示催化机制】
模拟显示L266H突变显著降低loop-4区柔性，而M285T突变增强与Fuc-α-1,3-GlcNAc的氢键相互作用（结合频率93.81% vs 野生型85.91%）。关键发现包括：催化酸/碱残基E255与GlcNAc的O-3距离缩短至0.4 nm，而O-6距离增大，从原子层面解释了1,3-选择性的提升机制。

【3.4 酶学性质表征】
突变体保持pH 7.5的最适活性，但水解活性降低（k_cat/K_m从237.19降至64.64 min^-1·mmol^-1），反映工程改造成功将催化偏好转向转糖基化。

该研究通过半理性设计实现α-L-岩藻糖苷酶区域选择性与活性的协同提升，创制的L266H/M285T突变体成为目前报道的最高效Fuc-α-1,3-GlcNAc生物合成催化剂。不仅为糖苷酶结构-功能关系研究提供新见解，更推动功能性寡糖的绿色制造进程。研究揭示的"柔性环区调控选择性-结合亚位点决定活性"的双轨改造策略，为其他糖苷酶的工程改造提供了普适性范式。