揭示纳豆芽孢杆菌 γ- 聚谷氨酸产量降低之谜：IS 插入与 Opp 系统的关键作用

在纳豆生产中，γ- 聚谷氨酸（γ-PGA）产量降低的突变株频繁出现，影响产品质量。研究人员针对此，以纳豆芽孢杆菌 BEST195 菌株为对象展开研究。结果发现 IS4Bsu1 或 IS1182Bsu1 插入寡肽通透酶（Opp）基因簇会降低 γ-PGA 产量。该研究为提升 γ-PGA 产量和保障纳豆质量提供了理论依据。

　　纳豆，作为日本传统发酵豆制品，凭借其丰富的营养和独特的口感，深受大众喜爱。它不仅富含蛋白质、多种维生素，尤其是维生素 K₂ ，还具有诸多健康益处，堪称功能性食品中的佼佼者。而纳豆那标志性的黏性，正是 γ- 聚谷氨酸（γ-PGA）赋予的。γ-PGA 由 γ- 聚谷氨酸合成酶（pgs）操纵子中的 pgsB、pgsC、pgsA 和 pgsE 基因编码的酶聚合谷氨酸而成，这一过程依赖 ATP 且不依赖核糖体。

然而，在纳豆生产过程中，γ-PGA 产量降低的菌株频繁现身，如同隐藏在暗处的 “捣乱分子”，严重影响了纳豆的质量和生产效益。此前研究虽发现插入序列（IS）IS₄Bsu1 插入 comP 区域会导致 γ-PGA 产量下降，但这并不能完全解释所有产量降低的现象。为了揭开这背后的神秘面纱，来自国外的研究人员踏上了探索之旅，相关研究成果发表在《Food Microbiology》杂志上。

研究人员选取了日本广泛用于纳豆生产的纳豆芽孢杆菌（Bacillus subtilis subsp. natto）BEST195 菌株作为研究对象。他们首先从该菌株中分离出具有异常菌落形态的突变株，并通过一系列实验对这些突变株进行深入分析。

在实验技术方面，研究人员采用了多种关键技术。其一，通过菌落直接 PCR 和琼脂糖凝胶电泳，检测 IS 在 comP 和 oppAB 区域的插入情况；其二，运用全基因组测序技术，对部分突变株进行测序，以确定突变位点；其三，利用半定量逆转录 PCR（RT-PCR），分析相关基因的表达水平。

在研究结果部分：

• 突变株的分离与分类：研究人员共获得 1260 个菌落，其中 79 个表现出异常形态，这些异常菌落被分为 A、B 两种类型。A 类型菌落白色、扁平，中心呈棉絮状向外扩散；B 类型菌落同样白色、扁平，但中心有小突起。正常的 BEST195 菌株菌落为奶油色，呈丘状且有褶皱，由此推测 A、B 类型菌株的 γ-PGA 产量可能降低。
• IS 插入分析：在 A 类型菌株中，11/13 的菌株检测到 IS₄Bsu1 插入 comP 区域，导致 γ-PGA 产量极少甚至无法检测，仅 A-4 和 A-13 菌株因 comA 和 comP 的单氨基酸替换突变，γ-PGA 产量显著降低但仍可检测。而 B 类型菌株中，51 株均未发现 IS₄Bsu1 插入 comP 区域，表明其突变位点在其他位置。
• γ-PGA 产量测定：经检测，A 类型菌株中多数 γ-PGA 产量极低或不可测，B 类型菌株虽未完全丧失 γ-PGA 生产能力，但产量明显下降。这一结果与菌落形态观察及 IS 插入分析相互印证。
• 突变位点鉴定：通过对 B 类型菌株的研究发现，其突变位点主要集中在 oppA 和 oppB 基因上。如 B-7 菌株 oppB 基因发生点突变，B-29 菌株 oppA 基因出现缺失突变，B-27 菌株中 IS₄Bsu1 插入 oppA 基因上游。此外，还在部分 B 类型菌株中发现 IS₄Bsu1 或新命名的 IS₁₁₈₂Bsu1 插入 oppA 或 oppB 区域，且不同菌株的插入位点和方向存在差异。
• 转录分析：对部分插入 IS 的 B 类型菌株进行半定量 RT-PCR 分析，发现 IS 插入会导致 oppA 和 oppB 基因转录完全丧失或大幅减少，进一步证实了 IS 插入对 Opp 系统功能的破坏。
• 纳豆产品生产：以 BEST195 菌株、A-1 菌株和 B-2 菌株进行纳豆生产实验，结果显示三种菌株在大豆表面生长情况无显著差异，但搅拌后，BEST195 菌株制作的纳豆有明显黏性丝状物，B 类型菌株黏性丝状物减少，A 类型菌株则几乎没有，这与之前 γ-PGA 产量检测结果一致。

综合研究结果和讨论部分，研究人员揭示了除 IS₄Bsu1 插入 comP 区域外，IS₄Bsu1 或 IS₁₁₈₂Bsu1 插入 Opp 基因簇也会损害 Opp 系统功能，进而显著降低 γ-PGA 产量。而且，B 类型突变株的出现频率更高，表明 Opp 系统突变可能是纳豆芽孢杆菌 γ-PGA 产量降低的更常见原因。同时，研究还首次证实了 IS₁₁₈₂Bsu1 在纳豆芽孢杆菌中的移动性。该研究为深入理解纳豆芽孢杆菌 γ-PGA 合成机制提供了新视角，有助于开发提高 γ-PGA 产量的策略，对维持纳豆产品质量具有重要意义，也为后续相关研究指明了方向，如进一步探究 Opp 系统与 γ-PGA 生物合成途径的相互作用机制等。