筛选高产核黄素长双歧杆菌婴儿亚种：从机制解析到应用潜力挖掘

核黄素（B2）对人体至关重要，其主要来源于饮食，部分乳酸菌和肠道微生物也能合成。为提升发酵食品核黄素含量，研究人员筛选长双歧杆菌婴儿亚种（Bifidobacterium longum subsp. infantis）高产菌株，发现相关突变，证实其安全性与应用潜力，为食品生物强化提供新途径。

　　在生命的舞台上，维生素扮演着不可或缺的角色，其中核黄素（维生素 B₂）更是与人体健康紧密相连。它作为黄素单核苷酸（FMN）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的前体，参与众多细胞内的关键过程。然而，人类自身无法合成核黄素，主要依靠饮食获取。一旦缺乏，铁吸收、色氨酸代谢、线粒体功能以及其他维生素代谢都会受到影响，还可能增加患癌症和心血管疾病等的风险。

为了满足人体对核黄素的需求，人们把目光投向了微生物。许多微生物具备合成核黄素的能力，比如一些存在于发酵食品中的微生物，以及栖息在人体肠道内的共生微生物。于是，开发能够产生核黄素的发酵剂，成为了生物强化发酵食品的热门策略。此前，不少研究聚焦于与食品相关的乳酸菌，像植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）等，但这些菌株大多并非人体肠道共生菌，难以在人体肠道内发挥作用。

在这样的背景下，来自国外的研究人员决定深入探索。他们将目标锁定在长双歧杆菌婴儿亚种（Bifidobacterium longum subsp. infantis）上。这是一类栖息在人体肠道内的共生微生物，部分菌株还具有益生菌特性，既能适应食品基质，又能在人体肠道生态系统中发挥作用。研究人员开展了一系列研究，旨在解析影响长双歧杆菌婴儿亚种中rib簇转录和翻译的潜在调控机制，同时筛选出核黄素高产菌株，并对其生产能力、安全性和技术特性进行研究。该研究成果发表在《Food Microbiology》上。

研究人员运用了多种关键技术方法。首先是基因组分析技术，对菌株的基因组进行测序，分析基因差异；其次是采用玫瑰黄素（roseoflavin）抗性菌株筛选法，获取核黄素高产菌株；之后利用 PCR 扩增和测序技术，分析rib操纵子；还通过高效液相色谱（HPLC）技术，对核黄素进行定量分析；最后借助 API-Zym 和 API-50CH 测试以及肉汤微量稀释板法，分别测定菌株的酶活性、碳水化合物利用情况和抗生素抗性。

1. 亲本菌株的特征

研究人员发现长双歧杆菌分为四个亚种，其中长双歧杆菌婴儿亚种常存在于母乳喂养婴儿的肠道中，且该亚种含有编码核黄素生物合成途径的rib簇，这或许赋予其在婴儿肠道微生物群环境中的适应性优势。对 CECT4551^T和 IPLA60011 菌株的基因组分析显示，IPLA60011 菌株的rfbP基因发生单核苷酸多态性（SNP），导致其无法合成胞外多糖（EPS），这也解释了该菌株与 CECT4551^T菌株在宏观和微观形态上的差异。

进一步分析rib簇，发现这两个亲本菌株的rib簇相同，均由ribD ribE ribA/B和ribH基因组成，属于ribDEAH操纵子。在rib操纵子的调控方面，上游的转录启动子和下游的转录终止子协同作用，同时，位于rib启动子和ribD基因之间的非翻译区（5′-UTR）中的核糖开关起着关键调控作用。当 FMN 过量时，它会与核糖开关的适配体结合，导致ribDEAH操纵子表达受到抑制。不过，长双歧杆菌婴儿亚种中rib操纵子的调控机制更为复杂，其核糖开关的表达平台结构特殊，可能涉及转录终止、RNA 加工和翻译衰减等多种调控方式。

2. 核黄素高产菌株的分离

研究人员利用玫瑰黄素（一种与核黄素类似的毒性物质）处理亲本菌株，筛选出了 10 个能够在含玫瑰黄素培养基中存活的克隆，其中 7 个来自 CECT4551^T菌株，3 个来自 IPLA60011 菌株。对这些克隆的ribDEABH操纵子测序发现，它们的 FMN 核糖开关适配体区域均出现不同的点突变。这些突变可能导致核黄素合成途径的调控失常，使菌株能够过量产生核黄素。

3. 高产菌株核黄素生产的体内外表征

通过 HPLC 对 8 个选定克隆及其亲本菌株在 RAMc 培养基中培养上清液的核黄素浓度进行定量分析，结果显示所有克隆产生的核黄素均显著高于亲本菌株，且来自 CECT4551^T菌株的克隆产生的核黄素浓度更高。对 6 个在 RAMc 培养基中核黄素产量较高的克隆在 MRSc 培养基中培养后进行检测，发现其核黄素产量在两种培养基中无显著差异，表明高产表型稳定。

研究人员还通过生物信息学分析，探究了核黄素产量与 FMN 核糖开关变化的关系。结果发现，突变体适配体的折叠结构发生改变，吉布斯自由能（ΔG）也有所变化。不同突变体的核黄素产量差异与适配体结构变化、关键核苷酸改变以及 ΔG 值相关，这些因素影响了 FMN 与适配体的结合以及ribD基因的翻译，进而影响核黄素的产量。

4. 核黄素高产突变体的代谢潜力和抗生素抗性

研究人员选取了两个核黄素高产菌株 IPLA60015 和 IPLA60012 进行进一步表征。酶活性分析表明，这四个菌株（两个亲本菌株和两个高产菌株）均具有较强的 β - 半乳糖苷酶活性，且其他碳水化合物水解酶活性也较高，说明牛奶是它们生长的良好底物，适合用于生产核黄素强化产品。在碳水化合物利用方面，四个菌株主要代谢乳糖，仅在利用 L - 甘露糖或 L - 岩藻糖上存在差异，但这与核黄素高产表型无关。

抗生素敏感性测试显示，所有菌株对大多数测试抗生素敏感，仅对链霉素表现出抗性。经分析，这种抗性可能源于rpsL基因的突变，且该突变在相关菌株中已得到证实，不存在抗性转移风险。综合来看，这些核黄素高产的长双歧杆菌婴儿亚种菌株可作为潜在的益生菌应用于食品领域。

研究人员成功筛选出长双歧杆菌婴儿亚种核黄素高产菌株，解析了相关调控机制，证实了这些菌株在食品应用中的安全性和潜力。这不仅为生物强化发酵食品提供了新的菌株选择，也为开发富含核黄素的功能性食品奠定了基础。未来，还需进一步研究这些菌株在食品生物强化中的实际应用效果，以及它们对肠道微生物群和宿主健康的影响，有望为人类健康带来更多益处。