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在食品分析中，1H NMR 常用于定量分析，但在复杂基质（如葡萄酒）中测定乙醇绝对浓度面临挑战。研究人员开展实验，探究影响因素。结果表明，葡萄酒类型影响最大，采用外部标准等方法可精准测定。该研究为葡萄酒乙醇检测提供新途径。
在美食与美酒的世界里，葡萄酒以其独特的风味和丰富的文化内涵备受喜爱。而在葡萄酒的众多品质参数中，乙醇含量不仅影响着口感，更是衡量其质量的关键指标之一。目前，葡萄酒中乙醇含量的检测方法多种多样，传统的蒸馏法操作繁琐，且误差较大；基于傅里叶变换红外光谱（FT-IR）的 WineScan 虽精度较高，但设备昂贵，限制了其广泛应用。质子核磁共振（1H NMR）光谱技术作为一种 “绿色” 且具有定量优势的分析方法，在食品质量控制领域应用广泛。然而，在葡萄酒这种复杂的基质中，由于乙醇浓度较高，比其他成分和共溶剂高出几个数量级，辐射阻尼、分子间相互作用等现象严重影响了 1H NMR 对乙醇绝对浓度的测定精度，导致其在葡萄酒乙醇定量分析方面的表现不如 FT-IR。为了突破这一技术瓶颈，来自国外的研究人员开展了一项深入研究，相关成果发表在《Food Research International》上，为葡萄酒行业提供了新的检测思路和方法，具有重要的意义。
研究人员主要运用了实验设计（DoE）和 1H NMR 光谱技术这两个关键方法。在实验设计方面，他们精心规划了两部分实验。第一部分针对不同浓度的乙醇水溶液，设置多个影响因素，每个因素有不同水平，以此测试 1H NMR 光谱在不同条件下对乙醇的定量能力；第二部分则选取多种不同类型的葡萄酒样本，应用第一部分优化的条件进行实际检测。在检测过程中，使用 Bruker Avance III 600 核磁共振仪采集 1H NMR 光谱数据，同时采用 WineScan FT 120 仪器基于 FT-IR 光谱技术测定葡萄酒中乙醇含量作为参考。通过对大量实验数据的处理和分析，最终得出研究结论。
乙醇定量的信号选择
在葡萄酒的 1H NMR 光谱中，乙醇会产生多个信号，包括位于 1.18 ppm 的甲基质子耦合产生的三重峰、3.687 ppm 的亚甲基质子耦合产生的四重峰，以及它们各自的 13C - 卫星峰。由于乙醇四重峰与甘油等其他物质的信号严重重叠，会干扰定量分析，所以研究人员舍弃了四重峰及其卫星峰，选择乙醇主三重峰（T）、其右卫星峰（S）以及两者结合（2×S + T）作为目标信号进行定量。此外，考虑到不同样品中 13C/12C 比例不同，为准确量化乙醇，研究人员计算了校正因子 k。通过对不同实验条件下乙醇溶液的研究发现，卫星峰与三重峰面积比（2xS/T）的校正因子 k 在 0.0111 - 0.0113 之间，这表明卫星信号面积约为主乙醇三重峰的 0.5%，有助于将乙醇信号调整到与其他葡萄酒代谢物相匹配的动态范围，提高定量准确性。
测量条件的优化
研究人员对多种实验参数组合进行了研究，包括不同的氘代溶剂、脉冲序列、NMR 信号区间和定量方法等，共得到 720 个计算面积。通过计算各组合下测量值与真实乙醇含量的相关系数发现，在多数情况下，原始求和法比多元曲线分辨率（MCR）更具优势。MCR 要求峰形在所有样品中保持一致，但高浓度乙醇会使信号展宽，加上辐射阻尼等物理现象导致信号畸变，影响 MCR 的量化效果。而使用 D2O 作为溶剂并采用水抑制（zgcppr）脉冲序列时，能获得更高的相关系数（R2 > 0.99）。在选择目标信号时，原始求和法对主三重峰以及卫星峰和主三重峰结合的测量准确性更高（R2 达 0.995）。此外，由于残留 d - DMSO 的 1H NMR 光谱会与葡萄酒中重要代谢物信号重叠，所以 D2O 被选为最佳锁场溶剂。
葡萄酒样品的案例研究
研究人员选取 20 种不同的葡萄酒（12 种红葡萄酒和 8 种白葡萄酒），按照优化后的实验条件进行测量。结果发现，使用 1H NMR 光谱测定葡萄酒中乙醇浓度的准确性不如 WineScan 测量结果，存在普遍低估的情况，相关系数 R2 仅为 0.91。通过方差分析同步成分分析（ASCA）发现，葡萄酒类型对乙醇三重峰面积的影响最大（效应量为 64%，p < 0.001），脉冲序列也有较小影响（效应量为 1.7%，p < 0.05），而实验重复次数无显著影响。在以 TSP 峰面积为响应的 ASCA 模型中，同样发现葡萄酒类型（效应量为 59.69%，p < 0.001）和乙醇含量（效应量为 14.48%，p < 0.001）影响显著，这表明基质效应严重影响了 TSP 峰面积，即使采用相同的标准操作流程制备样品，TSP 峰面积仍会因葡萄酒样品不同而变化。
为克服基质效应，研究人员采用外部标准法进行乙醇定量。以 TSP 为参考化合物，通过特定计算得到常数 kext。使用外部标准法后，葡萄酒类型的影响显著降低，表明该方法能有效补偿 TSP 峰面积的变化。通过这种方法，乙醇测量的不确定性估计为 0.23%（v/v），相关系数 R2 达到 0.99，显著提高了葡萄酒中乙醇定量的准确性。
研究结论和讨论部分表明，虽然在简单的乙醇 - 水溶液中，以 TSP 为内标用 1H NMR 光谱进行乙醇绝对定量较为容易，但在像葡萄酒这样复杂的样品基质中，由于代谢物与标准物质的相互作用会影响标准物质的定量性能，因此建议使用外部标准或人工信号来避免准确性和精密度方面的潜在差异。同时，研究强调了考虑 13C/12C 同位素比的重要性，忽略这一因素会导致计算出的乙醇浓度不准确。该研究为葡萄酒行业提供了一种更精准的乙醇绝对浓度测定方法，有助于提高葡萄酒质量控制水平，推动葡萄酒行业的发展。在未来的研究中，可以进一步探索其他可能影响乙醇定量的因素，不断优化检测方法，以适应更复杂的实际应用场景。
