模型引导代谢工程：开启大肠杆菌高效生产 C12脂肪酸的新征程

为解决传统方法难以高效生产 C12脂肪酸的问题，研究人员利用基于约束的建模和 Optknock 算法，对大肠杆菌进行研究。结果发现 9 个基因靶点，最高产菌株（ΔmaeB Δndk ΔpykA）产量提升 7.5 倍，证明该方法可优化生产。

　　在当今化工领域，石油基化学品虽然重要，但石油资源不可再生，使用过程还会带来环境污染。于是，从植物脂肪中获取的脂肪酸衍生的油脂化学品，作为有潜力的替代品崭露头角。它在制药、生物塑料、生物燃料等多个领域都有广泛应用。然而，植物源油脂化学品生产存在不少问题。一方面，用于生产的作物会与粮食生产竞争；另一方面，植物中脂肪酸种类有限，像不饱和月桂酸（不饱和 C₁₂脂肪酸）这种特定脂肪酸，用传统方法生产既不经济也不节能。

在此背景下，利用微生物进行生物合成成为解决问题的新方向。许多微生物能高效生产高价值生化产品，且对生产条件要求不苛刻。大肠杆菌作为理想的模式生物，此前已成功用于生产多种生物分子，其代谢网络也被深入研究。于是，来自 VIB - KU 鲁汶微生物中心、KU 鲁汶微生物与植物遗传学中心等研究机构的研究人员，开展了一项旨在提高大肠杆菌生产 C₁₂脂肪酸能力的研究。该研究成果发表在《Applied Microbiology and Biotechnology》上。

研究人员采用了多种关键技术方法。首先，利用基于约束的重建和分析（COBRA）工具包中的 Optknock 算法，对大肠杆菌基因组规模代谢网络模型 iML1515 进行计算模拟，以此识别潜在的基因敲除靶点。其次，通过构建单基因和多基因敲除突变体，并测定其脂肪酸产量来验证模拟结果。此外，运用气相色谱（GC）技术对脂肪酸进行定量分析，同时利用生长曲线测定菌株的生长情况。

下面来看具体的研究结果：

• 计算机模拟识别基因敲除靶点：为找到能提高大肠杆菌 C₁₂脂肪酸产量的代谢基因，研究人员运用 COBRA 工具包中的最新全基因组代谢网络模型 iML1515。在模拟中，他们设定富含葡萄糖和氨基酸的培养基，使大肠杆菌能积累生物量。由于大肠杆菌天然不产生 C₁₂脂肪酸，研究人员通过表达植物来源的 BTE 硫酯酶，将其转化为 C₁₂脂肪酸生产者。研究人员采用两种策略识别基因靶点：一是单目标策略，通过通量平衡分析（FBA）找到能提高 FA120 ACPHi 通量的反应；二是双目标策略，利用 Optknock 算法在优化 FA120 ACPHi 通量的同时，确保最低生长率。最终，基于这两种策略，确定了 9 个独特基因的 8 个敲除突变体，这些基因涉及回补反应、芳香族氨基酸合成、碳代谢和辅因子平衡。
• 实验验证计算机模拟结果：研究人员在大肠杆菌 BW25113 中引入经密码子优化的 BTE 序列，并诱导其表达。他们确定了最佳诱导剂浓度，发现当浓度为 100 ng/mL 时，C₁₂脂肪酸产量显著增加。之后，在 LB 培养基（含或不含葡萄糖）中对预测的基因敲除突变体进行实验验证。结果表明，不同基因敲除对 C₁₂脂肪酸产量有不同影响。例如，在葡萄糖缺乏的 LB 培养基中，ΔaroA 和 ΔaroC 突变体虽降低了总脂肪酸产量，但不饱和 C₁₂脂肪酸产量不变，导致其占比增加；ΔaroL 突变体使 C₁₂脂肪酸产量提高三倍，总脂肪酸产量不变。而在葡萄糖丰富的 LB 培养基中，基因敲除对饱和 C₁₂脂肪酸影响更大。综合来看，最佳生产菌株为 ΔmaeB Δndk ΔpykA，在葡萄糖缺乏条件下，其 C₁₂脂肪酸产量比原始菌株提高 7.5 倍，达到约 6.7 mg/L；在葡萄糖丰富条件下，ΔmaeB Δndk ΔpykA ΔaroC 菌株产量最高，为野生型的 2.5 倍。此外，研究还发现培养基中葡萄糖含量会显著影响 C₁₂脂肪酸的饱和度，葡萄糖缺乏时，90% 的 C₁₂脂肪酸为不饱和形式；葡萄糖丰富时则相反。

研究结论与讨论部分指出，该研究成功构建了能在总脂肪酸池中产生更高水平 C₁₂脂肪酸的大肠杆菌菌株。通过结合计算方法和最新的基因组规模代谢重建模型，确定了非明显的基因敲除靶点，使过表达 BTE 的大肠杆菌能将碳通量重新导向非天然的 C₁₂脂肪酸。发现的促进 C₁₂脂肪酸生产的基因敲除可大致分为与回补反应、芳香族氨基酸代谢、中心碳代谢和辅因子平衡相关的途径。不过，基于约束的代谢建模存在局限性，它未考虑动力学、转录和翻译调控等因素，可能导致假阳性结果。而且，研究使用的是实验室常用菌株，产量远低于高度工程化的工业菌株。但总体而言，该研究证明了基于约束的建模是发现新型基因工程靶点以优化菌株的宝贵工具，未来通过优化培养基成分和加工条件，有望进一步提高产量。这一研究为微生物生产 C₁₂脂肪酸开辟了新途径，对推动油脂化学品的可持续生产具有重要意义。