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在害虫防治中，小菜蛾对杀虫剂抗性问题突出。研究人员针对小菜蛾（Spodoptera exigua）细胞色素 P450 酶基因 CYP321B1 展开研究，发现转录因子 CncC/Maf 及启动子顺式突变协同促进其过表达，该成果为害虫治理策略提供新思路。
在农业生产的大舞台上，害虫一直是让农民们头疼不已的 “捣乱分子”。小菜蛾（Spodoptera exigua）作为一种分布广泛、食性繁杂的害虫，对众多农作物都造成了严重破坏。长期以来，化学杀虫剂是防治小菜蛾的主要手段，然而，随着时间的推移，小菜蛾逐渐对各类杀虫剂产生了抗性，这使得防治工作变得愈发困难。细胞色素 P450 酶在昆虫对外源物质的解毒过程中发挥着重要作用，其中 P450 基因的过表达与昆虫抗药性密切相关，但具体的调控机制却如同迷雾一般，让人难以捉摸。在这样的背景下，为了深入了解小菜蛾抗药性的分子机制，江苏大学科技学院、南京农业大学等机构的研究人员踏上了探索之旅。
研究人员通过一系列实验，得出了令人瞩目的结论。他们发现，CYP321B1 基因的上调赋予了小菜蛾对有机磷（毒死蜱，chlorpyrifos）和拟除虫菊酯（氯氰菊酯，cypermethrin；溴氰菊酯，deltamethrin）类杀虫剂的抗性。转录因子 CncC/Maf 的过表达能够促进 CYP321B1 基因的表达，并且在该基因启动子区域存在一个特定的结合位点，对 CncC/Maf 的结合及激活 CYP321B1 基因的表达至关重要。此外，抗性品系中 CYP321B1 基因启动子区域的顺式突变产生了新的结合位点，便于 POU / 同源域转录因子 Nubbin 的结合，进一步增强了该 P450 基因的表达。而且，反式作用因子（CncC/Maf）和启动子区域顺式作用突变协同作用，共同调节 CYP321B1 基因的过表达。这些研究成果发表在《BMC Biology》上，为后续制定有效的害虫综合治理策略提供了关键的理论依据。
在研究过程中，研究人员运用了多种关键技术方法。首先，利用杆状病毒表达系统在 Sf9 细胞中表达 CYP321B1 蛋白，以此来研究其功能；通过高效液相色谱（HPLC）分析重组蛋白对杀虫剂的代谢能力；构建转基因果蝇（Drosophila melanogaster）模型，探究 CYP321B1 基因过表达在体内对杀虫剂抗性的影响；借助同源建模和分子对接技术，研究 CYP321B1 蛋白与杀虫剂的相互作用；运用基因组步移、荧光素酶报告基因检测等方法，深入剖析基因表达的调控机制 。
下面来详细看看具体的研究结果。
- 重组 CYP321B1 体外杀虫剂代谢：研究人员在 Sf9 细胞中成功表达了重组 CYP321B1 蛋白，经检测，该蛋白具有良好的功能。催化活性测试表明，它能够高效催化 7 - 乙氧基香豆素（ECOD）。HPLC 分析显示，在 NADPH 存在的情况下，重组 CYP321B1 能够有效降解毒死蜱、氯氰菊酯和溴氰菊酯，这表明 CYP321B1 过表达与小菜蛾对这些杀虫剂的抗性相关。
- CYP321B1 过表达增强果蝇对杀虫剂耐受性：利用 GAL4/UAS 系统构建了表达 CYP321B1 的转基因果蝇。实验结果显示，与对照组相比，转基因果蝇在接触毒死蜱、氯氰菊酯和溴氰菊酯后，死亡率显著降低，这进一步证实了 CYP321B1 过表达赋予小菜蛾对这三种杀虫剂的抗性。
- 同源建模和对接：通过同源建模和分子对接技术发现，CYP321B1 蛋白与毒死蜱、氯氰菊酯和溴氰菊酯紧密结合，并且明确了它们之间的结合模式和相互作用的具体情况。
- CncC/Maf 过表达调节 CYP321B1 基因表达：研究人员鉴定出 CYP321B1 基因上游 1380bp 的启动子序列，预测分析发现该区域存在多个转录因子结合位点。通过实验证实，CncC 和 Maf 的过表达能够增强 CYP321B1 基因启动子的活性，从而促进该基因的表达。
- CYP321B1 启动子区域 CncC/Maf 结合位点鉴定：对 CYP321B1 基因启动子区域进行分段构建和突变分析，确定了 CncC/Maf 的有效结合位点位于 - 258 至 - 1bp 区域，并且该位点对激活 CYP321B1 启动子至关重要。
- 启动子区域顺式作用突变增强 CYP321B1 基因表达：对小菜蛾抗性和敏感品系 CYP321B1 基因启动子序列分析发现，抗性品系启动子活性更高。进一步研究确定，导致启动子活性差异的突变位于 - 258 至 - 210bp 区域，其中 M2 位点的突变能够显著上调 CYP321B1 基因的表达，且该突变位点位于 Nubbin 的预测结合位点。
- 反式作用因子 CncC/Maf 和顺式作用突变协同促进抗性品系中 CYP321B1 表达增加：实验表明，CncC/Maf 过表达和启动子区域顺式作用突变协同作用，对 CYP321B1 基因启动子活性的提升效果远大于两者单独作用之和，共同促进了该基因在抗性品系中的过表达。
综合研究结论和讨论部分，此次研究意义重大。研究明确了 CYP321B1 在小菜蛾抗药性中的关键作用，这不仅有助于理解其他害虫抗药性的发展机制，还为筛选害虫防治的新靶基因提供了方向。CncC/Maf 作为调节一系列解毒基因表达的关键转录因子，有望成为开发害虫防治药物的新靶点。同时，启动子区域顺式作用突变可作为监测抗性的标记，为制定精准的害虫综合治理方案提供依据。这些研究成果为解决害虫抗药性问题带来了新的曙光，让我们在与害虫的 “斗争” 中有了更有力的武器。
