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奶牛热应激严重影响其生产与健康，限制乳业发展。研究人员开展奶牛热应激下全基因组 DNA 甲基化调控机制研究，鉴定出相关差异甲基化区域（DMRs）和基因（DMGs），为培育耐热奶牛提供新靶点和表观遗传标记。
在全球气候变暖与乳业集约化发展的大背景下，奶牛养殖面临着严峻的挑战。奶牛体型庞大、皮毛厚且汗腺不发达，对高温环境极为敏感。当环境温度超过其适宜生存温度范围（5 - 25°C）时，奶牛就会遭受热应激。热应激会激活奶牛下丘脑 - 垂体 - 肾上腺轴，导致糖皮质激素水平上升，引发免疫抑制和代谢紊乱；还会诱导线粒体功能障碍，促使活性氧（ROS）积累，引发氧化应激反应，造成蛋白质变性、脂质过氧化和 DNA 损伤；此外，热应激还会重新编程能量代谢，致使牛奶产量下降、品质降低，给乳业带来巨大经济损失。例如，仅美国每年因热应激导致的泌乳奶牛经济损失就高达 15 亿美元。
为了深入了解奶牛热应激的应对机制，北京交通大学生命科学与生物工程学院、中国农业大学动物科技学院等研究机构的研究人员，开展了关于奶牛热应激下全基因组 DNA 甲基化调控机制的研究。该研究成果发表在《BMC Genomics》杂志上，为培育耐热奶牛提供了重要的理论依据和潜在靶点，对推动乳业可持续发展具有关键意义 。
研究人员运用了多种关键技术方法。在样本采集方面，从北京三元青莲宝岛牧场选取 15 头健康、处于相同泌乳期和胎次且无遗传关系的中国荷斯坦奶牛，分别在春季（非应激期）和夏季（热应激期）采集其尾静脉血样。在实验技术上，采用全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）构建奶牛全基因组甲基化图谱；运用生物信息学分析技术，如使用 R 包 MethylKit 鉴定差异甲基化区域（DMRs）和差异甲基化基因（DMGs），并进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析；通过实时荧光定量聚合酶链式反应（RT - qPCR）验证关键基因的表达；利用亚硫酸氢盐转化和巢式聚合酶链式反应（Nested PCR）检测特定基因区域的甲基化水平；构建启动子荧光素酶报告质粒，进行双荧光素酶活性检测，探究基因表达调控机制。
下面来详细看看研究结果：
- 春夏季奶牛全基因组甲基化模式：研究检测了 15 头奶牛的春夏季血样，发现春夏季奶牛全基因组平均甲基化水平差异不显著，CpG 甲基化比例最高，超过 90%。各染色体甲基化水平在春夏季相似，如染色体 24 的 CpG 甲基化水平最高，染色体 27 最低；染色体 13 的 CHH 和 CHG 甲基化水平最高，染色体 X 最低。
- 春夏季奶牛差异甲基化区域的鉴定与注释：研究共鉴定出 49861 个 DMRs，其中大部分位于基因间区，且热应激下基因启动子区域的 DMRs 多为高甲基化。这些 DMRs 对应 7613 个 DMGs，包括 214 个非编码 RNA、36 个编码 rRNA 和 3090 个蛋白质编码基因。在 4069 个启动子区域的 DMGs 中，有 19 个热休克蛋白家族基因启动子甲基化水平变化显著，HSPA1A、HSPA1L 和 HSPA6 是蛋白 - 蛋白相互作用（PPI）网络中的关键节点。
- 春夏季奶牛启动子区域 DMGs 的 GO 富集和通路分析：对 4069 个启动子区域的 DMGs 进行注释和功能富集分析，发现这些基因显著富集在 “运输调控”“活性氧代谢过程”“氧化磷酸化”“长寿调节” 等与热应激密切相关的 GO 术语和 KEGG 通路中，表明 DNA 甲基化可能通过影响这些过程来应对热应激。
- 热应激下奶牛启动子关键 DMRs 和 DMGs 的鉴定：结合 WGBS 数据和转录组测序结果，研究人员鉴定出 264 个差异甲基化且表达的基因（DMEGs），其中 157 个基因的甲基化变化与基因表达水平呈负相关。DNLZ 基因在这些基因中差异 FDR 值最小，在 PPI 网络中具有较高连接性，因此被选为关键研究对象。
- 热应激下奶牛中 DNLZ 表达随启动子甲基化增加而受抑制：通过软件预测发现 DNLZ 基因启动子区域存在一个 395bp 的 CpG 岛，在热应激奶牛中，该区域特定 CG 位点甲基化水平显著增加，DNLZ 基因表达水平显著下调，同时甲基转移酶和甲基结合蛋白的表达增加，表明热应激可能通过上调这些蛋白来增加基因的 DNA 甲基化水平。
- 热应激下 Mac - T 细胞中 DNLZ 表达随启动子甲基化增加而受抑制：以 Mac - T 细胞为模型，在 39℃热处理 48 和 72h 后，发现 DNLZ1 区域整体甲基化水平显著上升，mRNA 表达水平显著下降，且甲基化相关酶表达上调，进一步证实热应激增加 DNLZ 基因启动子甲基化水平并抑制其表达。
- DNLZ 基因甲基化启动子在体外抑制其表达：构建 PGL3 - DNLZ 启动子荧光素酶报告质粒并进行体外甲基化处理和共转染实验，结果表明启动子甲基化显著抑制 DNLZ 转录表达，且甲基化程度与转录抑制强度正相关。
研究结论表明，该研究揭示了奶牛热应激反应中全基因组 DNA 甲基化的调控机制。鉴定出的 49861 个 DMRs 和 7613 个 DMGs 显著富集在物质运输、氧化应激代谢、信号转导和能量代谢等关键通路中。其中，DNLZ 基因启动子区域在热应激下甲基化水平显著增加，导致基因表达受抑制。体外实验验证了 DNLZ 启动子甲基化对转录活性的抑制作用，说明其参与了奶牛对热应激的响应。
在讨论部分，研究指出虽然该研究系统揭示了 DNA 甲基化在奶牛热应激反应中的重要作用，但仍存在一定局限性。例如样本量较小，且 WGBS 阶段采用混合样本策略，可能掩盖个体间的表观遗传变异；仅以血液为采样组织，无法完全反映关键靶组织的特异性调控机制；相关结论主要基于体外模型，难以完全模拟奶牛体内复杂的生理状态。未来可结合动物模型和原代细胞进一步探究关键基因在热应激中的表观遗传调控机制，为培育高产、耐热的优质奶牛品种提供理论支持和技术保障。总之，该研究为奶牛耐热性状的分子育种提供了新的分子靶点和潜在的表观遗传标记，对推动乳业发展具有重要意义。
