重大突破！揭秘过氧化物酶体蛋白 N 端信号序列的导入机制

《Nature Cell Biology》：Import mechanism of peroxisomal proteins with an N-terminal signal sequence

过氧化物酶体对人体健康至关重要，其基质蛋白的导入机制备受关注。为探究 PTS2 蛋白的导入机制，研究人员通过体外重构系统和体内实验，发现 PTS2 蛋白经 YG 相导入，PEX7 在其中起关键作用。该研究为理解过氧化物酶体蛋白运输提供重要依据。

　　过氧化物酶体在人体健康中扮演着不可或缺的角色，它就像细胞内的 “清洁小卫士”，承担着脂肪酸 β - 氧化、醚脂生物合成等重要代谢任务。过氧化物酶体中的基质蛋白是在细胞质中合成后运输进去的，且是以折叠状态，甚至是寡聚体或预形成复合物的形式进入，这和只能导入未折叠多肽的内质网、线粒体截然不同。

大多数过氧化物酶体基质蛋白含有位于羧基（C）末端的 1 型过氧化物酶体靶向信号（PTS1），其导入机制已相对明晰。然而，部分基质蛋白使用位于氨基（N）末端的 PTS2 信号，其导入机制却一直是个谜。PTS2 蛋白包括几乎所有真核生物中过氧化物酶体 β - 氧化所需的硫解酶，以及对支链脂肪酸进行解毒和产生髓鞘形成所必需的醚脂前体的酶。人类中 PTS2 蛋白导入缺陷会引发 Refsum 病和危及生命的疾病 —— 点状软骨发育不良。所以，深入探究 PTS2 蛋白的导入机制迫在眉睫，这不仅有助于我们理解细胞的正常生理过程，还可能为相关疾病的治疗提供新的思路。

来自哈佛医学院（Howard Hughes Medical Institute 和 Department of Cell Biology）的研究人员 Michael L. Skowyra 和 Tom A. Rapoport 针对这一问题展开了深入研究，相关成果发表在《Nature Cell Biology》上。

研究人员采用了多种关键技术方法来开展研究。他们利用爪蟾卵提取物进行体外重构实验，模拟 PTS2 蛋白的导入过程；通过构建多种质粒，在大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母中表达重组蛋白；运用免疫印迹、细胞分级分离、荧光显微镜成像等技术对蛋白进行检测和分析；还制备了含有特定结构域的重组蛋白片段，用于构建 YG 水凝胶，研究蛋白与水凝胶的相互作用。

下面来看具体的研究结果：

• PTS2 蛋白通过 YG 相导入：研究人员利用爪蟾卵提取物重构 PTS2 蛋白的导入过程，发现 PTS2 货物在 PEX7 和长受体亚型 PEX5L 存在时能在提取物中形成亮点，表明 PTS2 导入途径是功能性的，但效率低于 PTS1 导入。通过构建含有酵母 PTS2 受体 PEX21 同源区域的嵌合受体 PEX5 - 21，增强了与酵母 PEX7 的结合力，提高了 PTS2 货物的导入效率。此外，研究证实 PTS2 蛋白的导入依赖受体的 WXXXF/Y 基序，且通过 YG 水凝胶实验表明 PTS2 蛋白可能通过 YG 相进入过氧化物酶体，PEX5 和 PEX7 对这一过程至关重要。
• PEX7 在 YG 相中的作用：研究发现 PEX7 能与 PEX13 的非结构化区域中保守的 KPWE 基序直接结合，且该结合位点与 PTS2 信号和导入受体的结合位点相互独立。PEX7 可以通过与 KPWE 基序结合或借助导入受体进入 YG 相，并且在与受体和货物形成复合物时，能利用这些相互作用将货物运送到过氧化物酶体中。
• KPWE 基序介导 PEX7 的回收：研究人员通过敲除酵母中 PEX13 的 KPWE 基序，发现 PEX7 在过氧化物酶体中的积累增加，表明 PEX7 无法返回细胞质。在爪蟾卵提取物实验中也证实了 PEX7 - GFP 只有与 PEX5 和货物组装成复合物才能进入过氧化物酶体，且 PEX7 的回收比 PEX5 慢。进一步通过降低 PEX7 的表达量，发现缺乏 KPWE 基序的细胞出现了明显的 PTS2 导入缺陷，这证实了 KPWE 基序在 PEX7 回收中的重要作用。
• PEX7 从 YG 相释放到细胞质：研究人员发现了一种名为 PEX39 的蛋白，它含有与 PEX13 的 KPWE 基序相似的 RPWE 基序，能与 PEX7 直接结合。实验表明，PEX39 可以从 YG 相中提取 PEX7，且在 PEX7 不再与货物和导入受体结合时发挥作用，不会干扰 PEX7 - 受体 - 货物复合物进入过氧化物酶体的转运过程。
• PEX7 的重新装载：AlphaFold 预测 PEX39 的两性螺旋（APH）可以稳定 PEX7 与 PTS2 信号的相互作用。实验证实，PEX39 不仅能从 YG 相中提取 PEX7，还能促进 PEX7 与货物的重新结合。当导入受体与 PEX7 结合时，会部分取代 PEX39，使货物复合物重新进入 YG 相，最终释放 PEX39 到细胞质中。

研究人员通过一系列实验，揭示了 PTS2 基质蛋白导入过氧化物酶体的详细机制。这一研究成果意义重大，它不仅完善了我们对过氧化物酶体蛋白导入机制的理解，还为相关疾病的治疗提供了潜在的靶点。例如，在 PTS2 蛋白导入缺陷导致的疾病中，通过调节 PEX7 的回收途径，有可能恢复正常的蛋白导入功能。此外，该研究还发现了 PEX7 与核转运受体的相似性，为进一步研究蛋白质转运系统的进化提供了线索，暗示了过氧化物酶体蛋白导入和核蛋白运输可能源于相同的祖先机制。