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在药物研发和化学生物学领域，E-64 作为重要的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，其生物合成机制却长期未知。研究人员开展了关于 E-64 生物合成途径及相关酶功能的研究。他们发现了新的生物合成途径和酰胺键形成酶，这为药物研发提供了新方法和思路。
在化学生物学和药物研发的舞台上，E-64 无疑是一颗耀眼的 “明星”。自 1978 年从曲霉中被分离出来，它作为一种不可逆的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，在多个领域发挥着关键作用。半胱氨酸蛋白酶广泛存在于生物体内，参与众多生理过程，与多种疾病的发生发展密切相关，是极具潜力的药物靶点 。E-64 能够精准地与半胱氨酸蛋白酶结合，其分子中的反式环氧琥珀酸（t-ES）弹头会与催化半胱氨酸的硫醇盐发生共价结合，从而抑制蛋白酶的活性。基于此，它不仅成为研究半胱氨酸蛋白酶功能的重要工具，还在药物研发中被寄予厚望，其多种合成类似物如 CA-074、CLIK-148 等，对不同的半胱氨酸蛋白酶展现出了选择性抑制作用。
然而，这颗 “明星” 背后却隐藏着一个长期未解的谜题 ——E-64 的生物合成机制。尽管它在科研和医药领域贡献卓越，但负责其合成的酶却一直未被明确。传统的生物合成研究思路在探寻 E-64 的合成路径时遭遇重重困难，因为其合成过程似乎并不依赖常见的非核糖体肽合成酶（NRPS）来形成酰胺键，而这种 NRPS 非依赖的酰胺键形成方式在真菌天然产物的生物合成中极为罕见，这使得研究人员难以确定正确的生物合成基因簇（BGCs）。
为了揭开这个谜题，来自美国加利福尼亚大学洛杉矶分校（University of California, Los Angeles）的研究人员踏上了探索之旅。他们开展了一系列深入研究，旨在明确 E-64 的生物合成途径，并挖掘其中关键的合成酶，期望为药物研发和化学生物学研究开辟新的道路。
研究人员运用了多种关键技术方法来开展这项研究。在基因分析方面，通过以 N - 二甲基赖氨酸脱羧酶 FlvG 为线索，对真菌基因组进行搜索，从而鉴定出潜在的 BGCs。在蛋白质研究中，利用重组蛋白表达和纯化技术获得关键酶，如 Cp1A、Cp1B、Cp1D 等。借助酶活性测定实验，结合液相色谱 - 质谱（LC-MS）、核磁共振（NMR）等分析手段，对酶的功能、底物特异性以及产物结构进行深入研究。此外，还通过蛋白质结晶和 X 射线衍射技术解析蛋白质结构，为理解酶的作用机制提供结构基础。
研究人员首先对 E-64 和其类似物的 BGCs 展开研究。他们在米曲霉（A. oryzae）和黄曲霉（A. flavus）等真菌中发现了两个潜在的 BGCs（acp1 和 acp2），每个 BGCs 编码四种蛋白质。通过在构巢曲霉（A. nidulans）中进行异源表达实验，证实了这些 BGCs 与 E-64 及其类似物的生物合成密切相关。其中，缺失 PLP 依赖的脱羧酶 cp1C 不影响代谢谱，而缺失 cp1A、cp1B 或 cp1D 则会阻断含 t-ES 化合物的产生，确定了 cp1A、cp1B 和 cp1D 构成最小的生物合成盒，且该三基因 BGCs 在众多真菌和蓝藻中广泛存在。
接着，对关键酶的功能进行了深入探究。研究发现，Cp1A 是一种（2S,3S）-t-ES 合酶，它能够在 Fe2+/α- 酮戊二酸（αKG）依赖的加氧酶作用下，将富马酸高效转化为（2S,3S）-t-ES。实验表明，Cp1A 具有立体选择性，只能催化游离富马酸的环氧化，对其他类似底物则无此活性。此外，它还具有多功能性，能催化琥珀酸脱氢生成富马酸并进一步环氧化。同时，来自蓝藻的同源酶 MfaA 也被证实具有类似功能。
对于酰胺键形成酶，研究人员发现 Cp1B 和 Cp2B 是形成假二肽的 ATP - 抓取酶。当以（±）-t-ES、l - 异亮氨酸（l-Ile）、腐胺等为底物进行反应时，确定了 Cp1B 负责催化（2S,3S）-t-ES 与 l - 氨基酸形成第一个酰胺键。通过结构分析，发现 Cp1B 具有典型的 ATP - 抓取酶结构，虽与其他已知的 ATP - 抓取酶序列相似度低，但也具有三个结构域和保守的 ATP 结合位点。此外，还研究了其底物特异性，发现它偏好与疏水性氨基酸反应，且对（2S,3S）-t-ES 具有立体特异性，可用于拆分外消旋的 t-ES。
进一步研究发现，Cp1D 和 Cp2D 是真菌中的酰胺键合成酶（ABS）。Cp1D 能够催化（2S,3S）-t-ES-l-Ile 与胺亲核试剂形成第二个酰胺键，其底物范围广泛，对多种胺类亲核试剂都能高效反应，且对不同的 N - 琥珀酰氨基酸（suc-AA）底物也有选择性偏好。同时，通过与其他已知细菌 ABS 对比，发现 Cp1D 和 Cp2D 属于不同的家族，它们主要激活 N - 酰基氨基酸和二肽。
基于这些发现，研究人员进行了酶促组合合成和抑制剂筛选。利用 Cp1B 和 Cp1D 广泛且正交的底物范围，通过一锅反应构建了包含超过 1200 种 E-64 类似物的文库。结合荧光检测方法，对人组织蛋白酶 B（cathepsin B）的抑制活性进行筛选，发现具有特定脂肪族氨基酸和某些胺基的类似物表现出更强的抑制活性。
在制备合成 E-64 类似物方面，研究人员通过一锅反应成功制备了多种目标化合物，产率在 28% - 54% 之间。这些化合物对 cathepsin B 的抑制活性进行了详细表征，部分化合物的半最大抑制浓度（IC50）值低于 E-64，且对 cathepsin L 和 K 也具有较强或相当的抑制活性，表明它们可作为泛组织蛋白酶抑制剂。此外，还展示了酶促合成与化学合成相结合的方法，用于制备选择性组织蛋白酶抑制剂，如 CLIK-148 和组织蛋白酶 C 选择性抑制剂，简化了合成步骤。
这项研究意义重大。在生物合成研究领域，首次从真菌中鉴定出两个新的酰胺键形成酶家族，即最初被注释为假设蛋白（HP）的 ATP - 抓取酶 Cp1B 和 Cp2B，以及被注释为 ANL 家族蛋白的 ABS Cp1D 和 Cp2D，明确了它们在 E-64 及其类似物生物合成中的作用，确立了真菌次级代谢中这种新的酰胺键形成模式。在药物研发方面，酶促组合合成技术的应用为构建化合物文库提供了高效的方法，有助于快速筛选出更具潜力的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，加速新型药物的开发。与传统化学合成相比，酶促合成具有诸多优势，如使用（±）-t-ES 为起始原料，避免了繁琐的立体选择性合成步骤；减少了保护和脱保护步骤；ATP 可通过辅因子循环方法再生，更加绿色环保。总之，该研究为生命科学和健康医学领域的研究提供了新的视角和有力的工具，为未来的药物研发和化学生物学研究奠定了坚实的基础。
