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本文研究发现抑制蛋白酶体活性可增强弥漫性间变性肾母细胞瘤（DAWT）对放线菌素 D（actD）的敏感性。通过多种实验表明，actD 处理后肿瘤细胞优先翻译蛋白酶体成分，联合蛋白酶体抑制剂硼替佐米（BTZ）能在体内外协同抑制肿瘤。这为治疗 DAWT 提供新方向。
引言
肾母细胞瘤（Wilms tumors）是儿童最常见的肾癌。北美风险分层标准将其分为组织学良好型和间变性。组织学良好型肾母细胞瘤（FHWT）经化疗、放疗和手术综合治疗，5 年总生存率超 90%，部分患者可降低治疗强度；而弥漫性间变性肾母细胞瘤（DAWT）约占肾母细胞瘤患者的 10% ，复发率超 40%，4 年总生存率仅 66%，强化化疗效果不佳且毒性增加。
自 20 世纪 60 年代起，放线菌素 D（actD）就用于治疗肾母细胞瘤等多种肿瘤，但在 DAWT 治疗中被移除，因其疗效不佳且存在毒性。actD 的分子活性具有浓度依赖性，低浓度时主要抑制核糖体 RNA（rRNA）和转运 RNA（tRNA）转录，影响核糖体形成和蛋白质翻译。本研究旨在探究如何提高 actD 敏感性，同时避免蒽环类药物的毒性，为肾母细胞瘤及其他恶性肿瘤治疗提供新策略。
结果
- actD 改变间变性肾母细胞瘤细胞的翻译景观：研究人员测定了两种间变性肾母细胞瘤细胞系 WiT49 和 17.94 对 actD 的敏感性，其半数最大抑制浓度（IC50）分别为 1.3 nM 和 2.2 nM。2 nM actD 可降低两种细胞系中 45s 前体 rRNA 和 18s 成熟 rRNA 水平，减少整体蛋白质合成。
通过核糖体分析、反相蛋白质阵列（RPPA）和 CRISPR 敲除筛选三种互补实验发现，actD 处理后，细胞优先翻译核糖体蛋白（RPs）和蛋白酶体成分，同时细胞周期基因翻译减少。在 CRISPR 筛选中，也发现与蛋白质周转、核酸周转和细胞周期相关的通路富集。RPPA 结果显示，actD 处理增加了 mTORC1 信号通路部分成分的磷酸化，同时减少了细胞周期标记物。
2. mTORC1 抑制不能使肾母细胞瘤细胞对 actD 敏感：基于 RPPA 结果中 mTORC1 信号中间体的磷酸化及此前对肾母细胞瘤中 mTORC1 信号的研究，研究人员用 Western blot 证实 actD 可诱导 WiT49 和 17.94 细胞中 AKT 和 4E - BP1 磷酸化。用雷帕霉素处理细胞发现其主要起细胞抑制而非细胞毒性作用，且 actD 与雷帕霉素联合使用未显示出明显协同作用，表明 mTORC1 抑制不能使肾母细胞瘤细胞对 actD 敏感。
3. ActD 诱导蛋白毒性应激，与蛋白酶体抑制在间变性肾母细胞瘤细胞中具有协同作用：虽然 mTORC1 信号可上调 RPs 翻译，但 72 小时 actD 处理实际上使 WiT49 和 17.94 细胞中多种 RPs 总蛋白水平略有降低，可能是多余的 RP 亚基在无 rRNA 时不稳定被蛋白酶体降解。同时，actD 处理使两种细胞系中多个蛋白酶体复合物亚基在 18 - 72 小时内显著增加，蛋白酶体糜蛋白酶样酶活性也相应增加，且该活性可被蛋白酶体抑制剂硼替佐米（BTZ）抑制。
WiT49 和 17.94 细胞对 BTZ 敏感，在纳摩尔浓度下，actD 和 BTZ 协同抑制两种细胞生长。actD 使细胞周期停滞在 G0/G1 期，减少 S 期细胞比例；BTZ 使细胞周期停滞在 G2 期，减少 S 期细胞比例。此外，BTZ 处理导致细胞凋亡标记物积累，actD 与 BTZ 联合作用可有效靶向间变性肾母细胞瘤。
4. actD 和 BTZ 联合治疗抑制肾母细胞瘤异种移植瘤的生长：研究人员在免疫缺陷小鼠中植入 17.94 细胞系来源的异种移植瘤和 TP53 突变的患者来源异种移植瘤（PDX）KT - 53，分别用溶剂、actD、BTZ 或两者联合处理。结果显示，联合治疗显著减小了肿瘤体积，延长了小鼠生存期，且 BTZ 耐受性良好，未增加毒性。
通过免疫组化检测增殖标记物 Ki - 67 和凋亡标记物 TUNEL 发现，联合治疗显著降低了肿瘤细胞增殖，增加了细胞凋亡，表明 actD 和 BTZ 联合治疗是靶向间变性肾母细胞瘤细胞的有效策略。
5. 蛋白酶体亚基表达水平与预后相关：研究人员分析了美国国家癌症研究所治疗应用研究生成有效治疗（TARGET）项目中 42 例 DAWT 和 83 例复发性 FHWT（rFHWT）样本的 RNA 测序数据，发现 DAWT 中 KEGG_PROTEASOME 基因集显著富集，且两个最富集的 Reactome 基因集与细胞周期蛋白降解相关，提示蛋白酶体降解可能促进 DAWT 细胞增殖。
进一步分析发现，rFHWT 患者中，蛋白酶体高表达患者预后较差；DAWT 患者中，蛋白酶体表达与预后关系不明显，但蛋白酶体中等表达患者预后比低表达患者差。这表明蛋白酶体亚基水平可能是 DAWT 和 FHWT 临床差异的基础之一，且高蛋白酶体亚基水平与 rFHWT 患者预后不良相关。
讨论
肾母细胞瘤研究虽已揭示其多种分子层面特征，但可靶向的脆弱位点仍不明确。间变性肾母细胞瘤对传统化疗耐药，actD 对癌细胞翻译景观的影响也知之甚少。本研究揭示 actD 破坏肾母细胞瘤蛋白稳态，蛋白酶体抑制可能是诱导间变性肾母细胞瘤对 actD 敏感的潜在靶向治疗策略。
蛋白稳态对癌细胞生长至关重要，actD 阻断蛋白质合成会导致细胞上调 Akt/mTORC1 信号，增加 RP 基因翻译，但 RP 蛋白未积累。mTOR 通路虽有治疗潜力，但 actD 与雷帕霉素联合未显示协同作用，不过其他 mTOR 信号抑制剂仍有研究价值。
此前研究发现肾母细胞瘤常见突变会干扰蛋白稳态，如 CTNNB1 和 MYCN 突变影响其降解，还有突变影响 microRNA 加工。此外，组蛋白赖氨酸去甲基酶 KDM4A - C 抑制剂可减少 rRNA 和 RP 转录，影响蛋白质翻译。而 actD 或 BTZ 与这些突变及 KDM4A - C 抑制的相互作用有待研究。
基于研究发现，蛋白酶体抑制可使细胞对 actD 敏感，这在体内外实验中均得到验证。蛋白酶体在应对蛋白毒性应激时会上调，Akt/mTORC1 可激活蛋白酶体亚基表达。BTZ 是首个获批的蛋白酶体抑制剂，已在儿科癌症患者中测试，但此前未见 actD 和 BTZ 联合治疗的研究。
蛋白酶体抑制剂在血液系统癌症治疗中取得成功，但在实体瘤治疗中效果不佳，可能与药物分布不足有关。增强 BTZ 在实体瘤中效果的策略包括脂质体纳米制剂和联合抑制其他蛋白酶体成分，本研究表明 actD 也可增强其效果，但联合治疗的耐受性需进一步研究，也可考虑使用新型蛋白酶体抑制剂。
在异种移植瘤研究中，联合治疗减少了增殖细胞，增加了凋亡细胞。体外实验和体内实验的差异表明，其他调节蛋白稳态的因素可能影响细胞对药物的反应，未来研究可通过更多细胞系、癌症类型或操纵相关因素来解释这些差异。
研究还发现 actD 可抑制细胞周期进展，这可能与蛋白稳态失调有关，BTZ 处理则诱导细胞凋亡。在 TARGET 队列中，高蛋白酶体基因表达与间变性组织学和 rFHWT 部分亚组的不良预后相关。本研究首次探索了 actD 治疗肾母细胞瘤的翻译景观，提出蛋白稳态依赖的 actD 敏感性模型，为肾母细胞瘤及其他使用 actD 治疗的肿瘤提供了新的治疗策略。
研究局限性
本研究存在一定局限性。体外研究仅针对两种间变性肾母细胞瘤细胞系，体内研究仅针对两种间变性肾母细胞瘤 PDX 系，样本量小，无法评估患者人口统计学或性别等因素对结论的影响，也未与 FHWT 细胞系或异种移植瘤比较，无法确定结论是否适用于非间变性肾母细胞瘤。
对人类肾母细胞瘤 RNA 测序数据的分析基于已发表的 TARGET 数据，仅包括 rFHWT 和 DAWT，无法确定蛋白酶体成分表达对初诊 FHWT 患者预后的预测价值，且这些回顾性数据的预测能力需在独立队列中验证。此外，临床前模型不能替代临床试验，actD 和 BTZ 联合治疗的毒性未知。
