极端嗜盐古菌的分子适应性机制：高氯酸盐耐受的奥秘与火星生命探索的启示

本文通过转录组学方法研究极端嗜盐古菌（Haloferax volcanii）对高氯酸盐（ClO4?）的耐受机制。发现高氯酸盐与盐度转录效应相反，“盐入” 策略及多种应激反应变化可促进耐受，成果有助于理解火星生命生存及原位资源利用。

　　

引言

高氯酸盐（ClO₄^?）是一种由氯原子和四个氧原子组成的可溶性阴离子，在火星表面多个位置被大量检测到。从天体生物学角度看，高氯酸盐可通过潮解促进液态盐卤水形成，这为思考火星上可能存在的宜居环境提供了重要依据。然而，高氯酸盐是强离液剂和氧化剂，具有毒性。它能破坏水分子间氢键网络，导致蛋白质和核酸变性、脂质双分子层不稳定以及氧化应激。尽管如此，仍有多种生物能耐受高氯酸盐，如某些蓝藻、耐盐真菌和细菌，尤其是极端嗜盐古菌。这些微生物耐受高氯酸盐的分子机制尚不明确。极端嗜盐古菌因具备多种适应火星环境的特性，如耐高盐、高氯酸盐，抗辐射、低温、干燥和高真空等，被认为是火星上可能存在的生命形式的最佳候选者。因此，本研究以模式极端嗜盐古菌 Haloferax volcanii 为模型，采用转录组学方法探究其对高氯酸盐耐受的分子机制。

结果与讨论

1. 高氯酸盐模拟盐度降低的效应：研究人员培养 H. volcanii 至指数生长期（OD₆₀₀ = 1.0），分别设置对照（Hv-YPC 培养基）、添加 350 mM NaClO₄处理组和添加 350 mM NaCl 的盐度对照组。对不同处理组进行 RNA 测序分析，发现受高氯酸盐影响显著表达的基因有 790 个（18.9%），受盐度影响的有 743 个（17.8%），受高氯酸盐盐影响的仅有 102 个（2.4%）。且高氯酸盐和盐度对基因表达的影响存在高度重叠，但作用相反，呈线性负相关。这表明高氯酸盐阴离子可能模拟盐度降低的转录组效应。极端嗜盐古菌采用 “盐入” 策略，细胞内积累高浓度 KCl 以维持渗透压平衡。K⁺作为亲液离子，有助于嗜盐蛋白维持天然构象，而高氯酸盐阴离子作为强离液剂，会破坏这种由 K⁺维持的蛋白水化壳，诱导蛋白变性。不过，细胞内高浓度的 K⁺可能屏蔽高氯酸盐的离液活性，使得极端嗜盐古菌对高氯酸盐有较高耐受性。
2. H. volcanii 对高氯酸盐的广泛转录适应：根据直系同源簇（COG）分类对高氯酸盐存在下的差异表达基因（DEGs）进行分析，发现多数 COG 类别中，诱导表达的 DEGs 多于抑制表达的，涉及翻译、转录、信号转导、蛋白质修饰与周转、能量代谢等多个过程。这表明 H. volcanii 通过触发高转录可塑性来适应高氯酸盐的毒性，这可能是其对高氯酸盐高耐受性的另一个原因。
3. 高氯酸盐诱导代谢转变和氧化物种清除：转录数据显示，高氯酸盐存在时，电子传递链（ETC）相关的多个基因表达改变。高氯酸盐抑制了细胞色素 c 氧化酶（Complex IV）的多个亚基 Cox 和 Cba 的表达，Complex IV 是细胞内活性氧（ROS）的主要来源之一，其活性受损可能有助于减少 ROS 生成，从而有利于对高氯酸盐的耐受。同时，卤青素（halocyanines）相关基因表达也发生变化，某些卤青素的差异表达可能通过减少电子向 Complex IV 的传递，防止氧自由基形成，促使细胞向更厌氧的代谢方式转变，进而提高对高氯酸盐的耐受性。此外，高氯酸盐还导致乳酸脱氢酶和丙氨酸脱氢酶等基因上调，乳酸转运体基因下调，这也支持了高氯酸盐存在下细胞向厌氧代谢转变的假设。另一方面，由于高氯酸盐的强离液活性会导致蛋白质和其他大分子变性，进而产生 ROS，H. volcanii 会增加超氧化物歧化酶（Sod）、过氧化物还原酶（Prx1 和 OsmC）以及铁氧还蛋白、硫氧还蛋白等基因的表达，这些蛋白可保护大分子免受 ROS 氧化，催化氧化还原反应降解 ROS 和其他氧化化合物。虽然盐度和高氯酸盐阴离子可能会改变溶解氧浓度，从而影响细胞代谢和 ROS 产生，但这些变化在 H. volcanii 适应高氯酸盐过程中起到了重要作用。
4. 高氯酸盐诱导 DNA 修复系统：当 H. volcanii 暴露于高氯酸盐时，参与不同 DNA 修复系统的基因被诱导表达。如碱基切除修复系统相关基因，包括尿嘧啶 - DNA 糖基化酶（ugd1、ugd2）、DNA 连接酶 1（ligA）、DNA - 3 - 甲基腺嘌呤糖基化酶 II 家族蛋白（HVO_2814）、瓣状核酸内切酶 1（fen1）等，以及重组相关基因，如 DNA 修复和重组蛋白 RadB（radB）、假定的 YegP 蛋白（HVO_2922）、DNA 错配修复蛋白 MutS2（mutS5b）等都上调表达。此外，编码非组蛋白蛋白的 mc1b 基因也被诱导，该蛋白类似于细菌的组蛋白样蛋白，有助于压实和保护 DNA。这些数据表明高氯酸盐会导致 DNA 损伤，而 DNA 修复和保护在 H. volcanii 对高氯酸盐的耐受中起着重要作用。
5. 蛋白质降解和伴侣蛋白是抵抗高氯酸盐的机制：高氯酸盐的离液活性主要影响之一是蛋白质变性。因此，蛋白质降解和修复错误折叠及受损蛋白质对于抵抗高氯酸盐至关重要。在高氯酸盐存在下，“翻译后修饰、蛋白质周转、伴侣蛋白”COG 类别中的多个基因上调表达。其中包括编码蛋白酶体组分的基因，如 psmA2 和 cdc48e，分别编码蛋白酶体催化和调节区域的亚基；还有编码 PAC2 家族蛋白的基因 HVO_0697，该蛋白可保护细胞免受蛋白酶体异常蛋白水解活性的影响。此外，某些蛋白酶和伴侣蛋白基因也上调，如 Hsp20（hsp20C）、前折叠蛋白（pfdB）、热休克蛋白 HtpX（htpX2）、锌依赖性蛋白酶（HVO_1555、HVO_0162）、蛋白酶活性调节因子 HflC（HVO_0035）等。这些蛋白酶和伴侣蛋白分别有助于降解和重折叠被高氯酸盐离液活性损伤或错误折叠的蛋白质，对高氯酸盐抵抗至关重要。
6. 高氯酸盐条件下的活跃翻译：转录组数据显示，H. volcanii 在暴露于高氯酸盐时，可能表现出翻译活性增加。多个编码起始和延伸因子的基因以及参与这些因子特定修饰生物合成的酶基因上调，如白喉酰胺合酶或脱氧 hypusine 合酶。同时，参与核糖体加工和成熟的基因也被诱导，如编码核仁蛋白 10（nop10）、RNA 结合蛋白 YhbY（HVO_1166）、rRNA 加工蛋白 FCF1（HVO_1900）等的基因。此外，许多编码核糖体蛋白的基因差异表达，这表明核糖体组成在高氯酸盐条件下发生变化。这种变化可能通过 “核糖体调节” 过程，促进特定 mRNA 的偏向翻译，调节高氯酸盐应激反应中相关 mRNA 的翻译。
7. 氨基酸和核苷酸代谢的改变：在核苷酸代谢方面，高氯酸盐存在下，许多参与嘌呤合成代谢的基因上调，这可能是为了增加 AMP 和 ADP 的可用性，以产生 ATP，满足伴侣蛋白和蛋白酶体重折叠或降解受损蛋白质、维持活跃的蛋白质周转、清除 ROS 或产生正确渗透调节所需的环二腺苷酸（c - di - AMP）的需求。在氨基酸代谢方面，多数参与该过程的 DEGs 的调节使得一般氨基酸合成代谢似乎被诱导，同时编码二肽通透酶（Dpp）蛋白的多个基因上调，Dpp 是一种 ATP 结合盒（ABC）转运蛋白，可导入二肽。氨基酸的假设积累可能与 H. volcanii 为适应高氯酸盐条件而进行的活跃翻译以及增加受损蛋白质周转有关。
8. tRNA 修饰对高氯酸盐和低盐度耐受性的影响：高氯酸盐存在时，多个与 tRNA 修饰生物合成相关的基因差异表达，如古菌 osine（arcS、tgtA、queD）、二甲基鸟苷（trm1）、胍丁胺（tiaS）、5 - 甲基氨基甲基 - 2 - 硫尿苷（hvo1856）、N⁶ - 苏氨酰氨甲酰腺苷（pcc1）等。研究人员通过过表达实验发现，过表达 hvo1856 基因会降低 H. volcanii 在高氯酸盐存在下的细胞生长，过表达 arcS 基因则会损害其在高氯酸盐和低盐度下的生长。hvo1856 编码一种 tRNA 5 - 甲基氨基甲基 - 2 - 硫尿苷甲基转移酶，该修饰可能增强 tRNA - Lys 对 Asn 密码子的错读，增加 Lys 蛋白含量，损害蛋白质稳定性，降低高氯酸盐抗性。arcS 编码古菌 osine 合酶，催化古菌 osine 生物合成途径的最后一步。虽然古菌 osine 被认为可增加 tRNA 稳定性，但过表达 arcS 却降低了 H. volcanii 对高氯酸盐的耐受性，这可能与 tRNA 结构改变有关。不过，古菌 osine 的功能仍不明确，它与细菌和真核生物中的 queuosine（Q）部分生物合成途径相同，推测其在古菌中可能具有与 Q 类似的翻译调节作用，还需进一步研究验证。

结论

极端嗜盐古菌似乎满足在火星表面富含高氯酸盐的液态卤水中生存的大部分条件。研究发现高氯酸盐阴离子与盐度对 H. volcanii 的转录效应相反，极端嗜盐古菌细胞内高浓度的 KCl 作为亲液离子，可能屏蔽高氯酸盐的离液效应。此外，H. volcanii 在应对高氯酸盐时表现出多种转录适应性变化，包括向厌氧代谢转变以减少 ROS 产生、增强 ROS 清除、重折叠和降解受损蛋白质、活跃翻译和氨基酸生成以维持蛋白质周转、通过 tRNA 修饰进行翻译微调等。这些结果有助于理解生命如何在火星上生存或古代火星生命可能如何进化，“盐入” 策略可能是耐受高盐度和高氯酸盐的有效生物学解决方案。同时，极端嗜盐古菌对高氯酸盐耐受的分子机制研究，为未来火星探索中的原位资源利用提供了重要参考，有望利用这些微生物开发原位资源利用策略。

材料与方法

1. 细菌菌株、培养基和培养条件：实验使用的细菌菌株包括大肠杆菌（Escherichia coli）DH10B、非限制性和非甲基化的 E. coli JTU007 菌株以及 H. volcanii DS70 菌株。E. coli DH10B 和 JTU007 分别在 37°C 和 30°C 的溶原肉汤（LB）培养基中常规培养。H. volcanii DS70 在 42°C 的 Hv - YPC 培养基中培养，该培养基含有酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白氨基酸和 18% w/v 的海水。根据需要添加抗生素，氨苄青霉素（AMP）终浓度为 100 μg/ml，新生霉素（NOV）终浓度为 0.3 μg/mL。固体培养基添加 15 g/L 琼脂或高贵琼脂。液体培养时在 200 rpm 的轨道平台上振荡培养。
2. 转录组学的 RNA 分离：将 H. volcanii DS70 预培养至 OD₆₀₀达到 1.0（指数生长期），然后分别设置对照、添加 NaClO₄和添加 NaCl（盐度对照）三组实验，每组 10 mL。为选择最佳 NaClO₄浓度，先将 10 mL OD₆₀₀为 1.0 的培养物分别与不同浓度（300、350 和 400 mM）的 NaClO₄孵育 6 h，每小时测量 OD₆₀₀，最终选择 350 mM 作为处理浓度，因为该浓度下 H. volcanii 仍能保持活跃生长。孵育 30 min 后，离心收集 1 mL 培养物中的细胞。使用 QIAGEN RNeasy Mini Kit 提取和纯化总 RNA，通过 DNase 消化去除基因组 DNA，用 Qubit Fluorometer 3.0 测定 RNA 浓度，Agilent 2100 Bioanalyzer 检测 RNA 完整性，所有样品的 RNA 完整性数（RIN）均高于 8.5，满足测序要求。
3. RNA 测序：在 FISABIO（西班牙巴伦西亚）按照制造商说明，使用 1 μg RNA 进行文库构建和 RNA 测序。使用 Ribo - off rRNA Depletion Kit 去除总 RNA 中的 rRNA，该试剂盒适用于 H. volcanii DS70。使用 TruSeq stranded mRNA Library Prep Kit（Illumina）为每个样品制备一个文库，在 NextSeq 500（Illumina）的一个高输出流动池上进行文库测序，测序读数为单端 75 bp，每个样品估计覆盖约 2000 万读数，生物项目登录号为 PRJNA967210。
4. 数据处理：使用 FastQC v0.11.9 工具对高通量序列数据进行质量控制，用 Trimmomatic v0.39 去除低质量读数。清理后，使用 Bowtie 2 v2.3.5.1 将读数与 H. volcanii DS2 参考组装基因组进行比对，并用 Samtools 1.9 进行排序和索引。使用 DESeq2 计算表达水平，识别不同处理对之间的差异表达基因，并分配校正后的 P 值以确定统计显著性。在高氯酸盐暴露的短期转录反应中，选择校正后 P 值 < 0.1 且折叠变化截止值为 ±1.8 的基因作为差异表达基因（DEGs）。
5. 构建过表达 tRNA 修饰生物合成相关基因的 H. volcanii 菌株：使用特异性引物将 H. volcanii 中编码参与多种 tRNA 修饰生物合成酶的基因（arcS、hvo1856、tiaS、pcc1、trm1）克隆到 pAJ 质粒中，pAJ 是一种在 H. volcanii 和 E. coli 中均有启动子功能的穿梭表达载体。通过电穿孔将构建体导入 E. coli DH10B 菌株，在 LB - AMP 平板上筛选阳性克隆并测序验证。为去除构建体中的甲基化，将从阳性 DH10B 克隆中分离的质粒通过电穿孔导入 E. coli JTU007 菌株，在 LB - AMP 平板上筛选阳性 JTU007 克隆并测序验证。从阳性 JTU007 克隆中分离的非甲基化构建体用于通过聚乙二醇介导的原生质球转化法转化 H. volcanii DS70 菌株，在 Hv - YPC - NOV 平板上筛选 4 天（42°C），并通过测序验证克隆。未能获得过表达 trm1 基因的克隆。
6. 测试高氯酸盐和盐度耐受性的生长曲线：将过表达 tRNA 修饰生物合成基因的 H. volcanii DS70 在 42°C 的 Hv - YPC - NOV 培养基中培养至稳定期，然后将其接种到含有 11%（低盐度）、18%（正常盐度）或 30%（高盐度）海水或 18% 海水加 350 mM NaClO₄的 Hv - YPC - NOV 培养基中，调整 OD₆₀₀为 0.05，在 42°C、200 rpm 条件下培养 3 天，在不同时间点测量 OD₆₀₀。
7. 通过点滴试验测试高氯酸盐耐受性：采用点滴试验测定 H. volcanii DS70 pAJ/arcS 菌株对高氯酸盐的抗性能力。将细胞在 42°C 的 Hv - YPC - NOV 培养基中培养至稳定期，调整 OD₆₀₀为 0.6，进行 10 倍系列稀释，然后将每个稀释度的 10 μL 液滴依次接种到添加 600 mM NaClO₄的 Hv - YPC - NOV 琼脂平板上，在 42°C 孵育 5 天。同时将液滴接种到 Hv - YPC - NOV 琼脂平板上以验证两种菌株的细胞活力相似，使用精密 DP70 CCD 相机（Olympus）拍照。
8. 统计方法：使用 GraphPad Prism version 9.00 计算统计参数，包括基于独立实验数据集的平均值和标准差（SD），以及高氯酸盐和盐度条件下 DEGs 折叠变化之间的相关性。使用 ClustVis 工具创建所有 DEGs 折叠变化的热图，应用单位方差行缩放。