鸡屠宰场弯曲杆菌全基因组测序：解析菌群动态，守护禽肉安全

本文运用全基因组测序技术，对鸡屠宰场的 324 株弯曲杆菌（Campylobacter）进行研究。发现其种群结构多样且动态变化，存在多种质粒与高耐药性。研究揭示了菌株传播、进化特征，为防控禽肉生产中的食源性病原体提供关键依据。

　　

引言

弯曲杆菌（Campylobacter）是全球细菌性胃肠道肠炎的主要致病菌，在加拿大，弯曲杆菌病是最常报告的细菌性食源性疾病，比李斯特菌（Listeria）、沙门氏菌（Salmonella）和大肠杆菌（Escherichia coli）感染的总和还多。其中，空肠弯曲杆菌（C. jejuni）和结肠弯曲杆菌（C. coli）是导致人类感染的主要菌种 。弯曲杆菌主要通过粪口途径传播，禽肉生产链是其重要的储存库 。以往研究追踪禽业病原体多依赖传统分型技术，而全基因组测序（WGS）具有诸多优势，已成为追踪和监测食源性病原体的金标准，但在食品生产领域对弯曲杆菌的应用研究较少。本研究旨在利用 WGS 技术对鸡屠宰场的弯曲杆菌种群进行特征分析，探究其多样性和动态变化。

结果

1. 弯曲杆菌分离株的基因组多样性和特征分析：研究人员在加拿大不列颠哥伦比亚省大温哥华地区的一家鸡屠宰场进行采样，分两轮，每周采集生物和环境样本，共获得 324 株无污染的弯曲杆菌，包括 268 株 C. jejuni 和 56 株 C. coli 。通过电子多位点序列分型（in silico MLST）分析，确定了 22 种序列类型（STs），发现 7 种新的 STs 。基于核心基因组多位点序列分型（cgMLST）系统发育分析，以 20 个等位基因差异为阈值，定义了 27 个弯曲杆菌谱系。不同谱系在不同时间出现，如 ST - 451 分离株有两个谱系，分别在不同周被检测到 。同时，在所有分离株中鉴定并表征了 448 个质粒，分为 10 个主要簇，部分质粒具有特殊特征，如 lineage 11727 的 type - 1 质粒中 tet (O) 基因缺失 。此外，还检测到多种抗生素耐药性（AMR），86% 的分离株对 β - 内酰胺类抗生素耐药，71% 对四环素耐药，48% 对喹诺酮类耐药，且多药耐药现象常见。
2. 各谱系内的种群结构：在 27 个谱系中，10 个谱系存在明显的种群结构差异。水平基因转移和 / 或点突变导致了这些谱系内亚种群的形成。例如，lineage 451b 中部分菌株通过染色体同源重组和丢失 pTet 质粒形成亚种群；lineage 824 中，前噬菌体序列的变异定义了亚种群；lineage 1629b 和 11717 则通过点突变形成不同亚种群，且这两个谱系的亚种群可根据分离日期明显区分。
3. 分离的弯曲杆菌谱系的时空分布：对所有分离的弯曲杆菌克隆的时空分布和基因组多样性分析显示，机器样本在所有 12 个采样日期均检测出弯曲杆菌阳性，阳性率最高（41.6%）。不同采样位置的阳性率有所差异，从夏季到冬季，肠道和板条箱样本的阳性率显著下降 。不同谱系在不同时间和样本中分布不同，部分谱系会在不同采样日期反复出现，如 lineage 1629b 在 5 个不同时间点出现。通过分析发现，弯曲杆菌在生物和环境样本之间存在传播，屠宰场环境是弯曲杆菌交叉污染和批次间传播的重要场所。
4. 与本研究谱系相关的公共分离株的地理分布：分析 NCBI 病原体数据库中与本研究谱系相关的公共分离株发现，27 个谱系中有 20 个在数据库中有相关分离株。大多数相关公共分离株来自美国，华盛顿州的分离株多样性较高 。对 lineage 1629a 和 1629b 的分析表明，它们在当地家禽生产生态系统中已经存在多年，且可能起源于共同祖先，在 2013 - 2016 年左右分化。

讨论

本研究通过纵向和横断面采样相结合的方法，对鸡屠宰场的弯曲杆菌种群进行了追踪和特征分析。弯曲杆菌在屠宰场的总体流行率为 38.2%，夏季流行率（43.0%）高于冬季（33.3%），夏季谱系多样性也更高 。研究还发现了多种质粒和高 AMR 流行率，凸显了当地家禽业持续进行 AMR 监测的必要性。谱系内亚种群的频繁出现可能反映了弯曲杆菌对农业环境的适应，水平基因转移在其中起到重要作用 。弯曲杆菌谱系可能在当地家禽养殖环境中定植和多样化，并从不同来源反复传入屠宰场，这表明可能存在隐藏的污染源，如水源或肉鸡饲料 。由于菌株的频繁重新引入，之前关于弯曲杆菌在屠宰场环境中持续时间（长达 21 天）的估计可能需要重新评估。此外，本研究强调了综合生物和环境采样以及 WGS 技术在理解弯曲杆菌交叉污染模式中的重要性，发现屠宰场环境是交叉污染的关键场所 。同时，研究还观察到屠宰场弯曲杆菌种群与公开数据之间存在很强的地理关联，某些谱系在当地家禽生产生态系统中占据主导地位。

材料和方法

1. 鸡屠宰场样本采集：在加拿大不列颠哥伦比亚省大温哥华地区的一家鸡屠宰场进行采样，该屠宰场采用两班制，每班处理一批来自不同农场的肉鸡（除了第 2 周和第 10 周的肉鸡来自同一农场）。每周从屠宰场的四个区域采集 38 个样本，包括环境样本（鸡笼和加工机械拭子）和生物样本（鸡肠道和肉产品冲洗液），共采集 456 个样本 。
2. 弯曲杆菌分离株的富集、筛选验证和命名：样本均质化后，取 0.5 mL 均质液在添加抗生素的 Bolton 肉汤中于 37°C、微需氧条件（10% CO₂）下富集 48 h，然后接种到添加更高浓度抗生素的改良木炭头孢哌酮脱氧胆酸盐琼脂平板上，37°C 微需氧培养 48 h 。从每个阳性样本中选择 3 个具有弯曲杆菌样形态特征的菌落，在添加 5% 脱纤维羊血的 Mueller - Hinton（MH）琼脂平板上纯化两轮，每次 37°C 微需氧培养 48 h 。通过多重 PCR（m - PCR）验证分离株的种类，验证后的弯曲杆菌分离株保存在 50%（vol/vol）甘油中，于 - 80°C 储存 。分离株命名采用 “(Week ID)-(Sample ID)(Colony ID)” 的方式。
3. DNA 提取、文库制备和测序：将储存于 - 80°C 的弯曲杆菌分离株在 MH 血琼脂平板上复苏，经 m - PCR 验证后，使用 Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit 提取基因组 DNA，进行 DNA 定量 。在 Michael Smith Genome Sciences Centre 进行文库制备和测序，文库读长为 150 bp，在 Illumina HiSeq 2000 平台上进行全基因组测序。
4. 质量控制、组装和污染检查：利用 FastQC 和 MultiQC 对测序原始文件进行碱基质量检查，使用 Kraken 2 评估物种丰度，通过 FASTP 进行接头修剪和低质量读段去除 。采用 Shovill 组装管道进行基因组组装，用 QUAST 评估组装质量，BUSCO 评估基因组完整性 。通过 in silico MLST 和核糖体 MLST（rMLST）进行分型，去除含有污染物或多个 MLST 等位基因异常的分离株。
5. 组装基因组的特征分析：使用 Bakta 进行基因预测和注释，以 C. jejuni NCTC 11186 为参考 。利用 AMRfinderPlus 鉴定与抗生素耐药性相关的基因组特征，通过自定义 R 脚本预测 OXA - 61 样基因的表达水平 。使用 MOB - suite 进行质粒预测和分型，并通过手动筛选排除错误预测的质粒。利用 R 中的 GGTREE 包可视化 AMR 和质粒图谱。
6. 核心基因组 MLST、谱系分配、变异检测和时间树构建：应用 Chewiesnake 管道生成 cgMLST 图谱，以 20 个等位基因差异为阈值进行聚类，构建邻接树并分配谱系 。使用 DiscoSNP 进行 SNP 检测，Gubbins 确定同源重组区域，RAxML 生成最大似然 SNP 树 。通过 Roary 确定每个谱系内分离株的辅助基因图谱 。利用 BactDating R 包构建时间树，以 2013 年在 BC 收集的 10 个分离株（ST - 1629）序列为外群。
7. 亚种群检测：通过计算成对 Pearson 相关系数（r²）矩阵评估 SNP 和辅助基因图谱的连锁不平衡 。当两个或多个菌株共享 10 个或更多高度相关（r²≥0.7）的 SNP 对（或三个或更多高度相关的基因对）时，计算 F_ST值 。当疑似种群内存在五个或更多高 F_ST特征（F_ST>0.7）时，确定为亚种群。