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本文聚焦杜氏利什曼原虫（Leishmania donovani）感染引发的黑热病皮肤后遗症（Post Kala-azar Dermal Leishmaniasis，PKDL）。研究发现 PKDL 患者中性粒细胞出现转分化，虽缺乏抗原呈递功能，但有助于寄生虫摄取，为理解疾病发病机制提供新视角，对防治策略制定意义重大。
引言
杜氏利什曼原虫感染人体后，通常寄生于髓细胞，如中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞中。中性粒细胞作为最先抵达感染部位的细胞，在吞噬利什曼原虫后，既可能发挥宿主保护作用，也可能促进寄生虫感染的建立。寄生虫可通过多种策略在中性粒细胞内存活，比如利什曼原虫的某些成分能抑制中性粒细胞的杀菌活性，部分种类还能逃避中性粒细胞胞外陷阱（NETs）的杀伤。
中性粒细胞在适应性免疫反应中也有功能贡献，其转分化现象是近年来的研究热点。转分化的中性粒细胞会获得树突状细胞样特性，表达如 CD83、MHC II、共刺激信号（CD80/CD86）等标记，成为中性粒细胞 - 树突状细胞杂交体（N - DCs）。此前研究已在多种疾病中观察到 N - DCs 的存在，但在 PKDL 中其存在情况尚未明确。本研究旨在探究 PKDL 患者循环中 N - DCs 的状态，以及中性粒细胞转分化在利什曼原虫感染发病机制中的作用。
研究结果
- 研究人群：本研究纳入 16 例 PKDL 患者，包括多形性（5 例）和斑疹性（11 例）两种类型，患者年龄、性别分布与健康对照组无显著差异。患者疾病持续时间和黑热病（Visceral Leishmaniasis，VL）与 PKDL 之间的间隔时间与以往研究相近。多数患者接受过抗利什曼原虫治疗，且所有患者 ITS - 1 PCR 检测均为阳性，通过 kDNA qPCR 对寄生虫载量进行了量化。
- PKDL 患者中中性粒细胞 - 树突状细胞杂交体的存在：通过流式细胞术对 PKDL 患者全血中的中性粒细胞进行分析，发现 PKDL 患者中双阳性 N - DC 杂交体（CD66b+/CD83+）的频率显著高于健康对照组。在 PKDL 患者中，CD66b+/CD83+中性粒细胞亚群的 CD83 荧光强度大幅增加，但该亚群中 HLA - DR、CD80 和 CD86 等共刺激分子的频率与健康对照组相比未发生改变。
进一步研究发现，PKDL 患者循环中 TNF - α 和 IFN - γ 水平显著升高，而 GM - CSF 水平与健康对照组相当。这表明，PKDL 患者中性粒细胞转分化可能与 TNF - α 和 IFN - γ 水平升高有关，但这些转分化的中性粒细胞缺乏典型 N - DCs 的抗原呈递功能。
3. 杜氏利什曼原虫在中性粒细胞中的感染建立及寄生虫载量定量：在体外感染模型中，用毒力强的杜氏利什曼原虫前鞭毛体（MHOM/IN/83/AG83）感染中性粒细胞，通过数字 PCR（ddPCR）检测无鞭毛体特异性基因 A2 的表达。结果显示，感染后 2 小时 A2 表达最高，随后迅速下降，显微镜观察也证实了这一结果，且感染寄生虫的中性粒细胞形态增大。而用低毒力的参考菌株 MHOM/IN/80/DD8 感染中性粒细胞，在各时间点均未检测到感染迹象，细胞形态也无明显变化。
4. 杜氏利什曼原虫感染中性粒细胞中转分化频率：感染 AG83 后，中性粒细胞形态发生改变，出现一个新的群体 P2，其事件数量在感染后显著增加，被认为是 “特洛伊木马” 亚群。感染 AG83 还导致 P1 群体中 CD66b+/CD83+转分化的 P3 亚群频率大幅增加，同时 P4（CD66b+/CD83-）亚群频率下降。在 P2 群体中，感染后所有细胞几乎都表现为 CD83 阳性（P5 亚群），且 P2/P5 亚群在大小、颗粒度和 CD83 表达方面均显著高于其他亚群。相比之下，DD8 感染中性粒细胞后，转分化频率变化极小，多数细胞仍为 CD66b+/CD83-。
5. 感染和转分化中性粒细胞的氧化还原状态：感染 AG83 后，中性粒细胞产生的活性氧（ROS）显著增加，转分化的 CD83+中性粒细胞产生的 ROS 比例高于 CD83-亚群。而 DD8 感染的中性粒细胞 ROS 生成量与未感染组相比无明显变化。这表明，毒力强的杜氏利什曼原虫感染可诱导中性粒细胞转分化并增强其 ROS 生成能力。
6. 感染和转分化中性粒细胞亚群的吞噬潜能状态：检测感染后中性粒细胞的吞噬潜能，发现感染 AG83 后，转分化的 CD66b+/CD83+中性粒细胞（P1/P3 和 P2/P5）吞噬标记物 CD44 的表达显著增加，吞噬潜能增强；而未转分化的 P1/P4 亚群 CD44 表达与未感染组相近。DD8 感染的中性粒细胞吞噬潜能则无明显变化。这说明，转分化与中性粒细胞吞噬功能增强相关，且这种增强具有菌株特异性。
7. 暴露于 CFDA - SE 标记的金黄色葡萄球菌后的吞噬状态：优化 CFDA - SE 标记金黄色葡萄球菌的条件后，发现感染 AG83 的中性粒细胞对标记的金黄色葡萄球菌的吞噬能力显著高于仅暴露于标记菌或感染 DD8 后再暴露的中性粒细胞，尽管各组吞噬细胞的百分比无显著差异，但 AG83 感染组的 CFDA 荧光强度更高，表明 AG83 感染可增强中性粒细胞的吞噬作用。
8. 杜氏利什曼原虫感染中性粒细胞的凋亡状态：研究发现，感染 AG83 可增强 P1 和 P2 中性粒细胞群体的凋亡，其中 CD66b+/CD83+转分化的 P2 群体凋亡最为明显。而 DD8 感染则不会改变中性粒细胞的凋亡状态。这表明，毒力强的杜氏利什曼原虫感染可诱导中性粒细胞凋亡，可能有利于寄生虫通过凋亡的中性粒细胞转移到巨噬细胞。
讨论
中性粒细胞转分化生成的 N - DC 杂交体具有双重特性，融合了中性粒细胞的杀菌作用和树突状细胞的抗原呈递能力，体现了免疫细胞的可塑性。在多种疾病中都观察到了 N - DCs 的存在，但其在利什曼原虫感染中的生物学意义此前尚未明确。
在 PKDL 患者中，虽然发现了转分化的 N - DCs（CD66b+/CD83+），但它们缺乏 MHC II/HLA - DR 和共刺激标记，表明其抗原呈递功能有限。PKDL 患者体内 TNF - α 和 IFN - γ 水平升高，而 GM - CSF 水平不变，这可能是导致这种非经典 N - DC 杂交体形成的原因。
实验模型表明，中性粒细胞在利什曼原虫感染初期对感染的建立起重要作用。毒力强的杜氏利什曼原虫可感染中性粒细胞并诱导其转分化，产生的 P2/P5 中性粒细胞群体转分化比例最高，而低毒力的 DD8 则无此现象。这进一步证实了转分化在促进感染中的作用。
感染杜氏利什曼原虫的 CD66b+/CD83+中性粒细胞亚群 ROS 水平升高，吞噬功能增强，显示出一定的抗微生物能力。但同时，ROS 的增加也使中性粒细胞更易凋亡，利于被巨噬细胞摄取，从而实现寄生虫的 “特洛伊木马” 式转移。综合来看，中性粒细胞是利什曼病的重要调节因子，未来的疾病干预策略可考虑针对触发其转分化的因素。
材料和方法
- 试剂：实验中使用的抗体主要来自 BD Biosciences，试剂多来自 Sigma Aldrich，部分特殊试剂如 rK39 免疫层析测试条、QIAmp DNA Mini 试剂盒等分别购自不同公司，用于细胞因子检测的 Bio - Plex ProTM Human Chemokine Panel 40 - plex 购自 Bio - Rad Laboratories。
- 研究人群：PKDL 患者通过主动和被动监测招募，共 16 例，临床诊断结合多种方法，包括临床特征、既往 VL 病史、rK - 39 检测和 ITS - 1 PCR 等，同时招募 15 例健康志愿者作为对照，采集其外周血和皮肤活检样本进行相关检测。
- 寄生虫培养：杜氏利什曼原虫（MHOM/IN/83/AG83 和 MHOM/IN/80/DD8）前鞭毛体在特定培养基中培养，定期传代。通过感染小鼠获得毒力强的 AG83 前鞭毛体，DD8 前鞭毛体经长期传代致弱。研究还检测了两种菌株前鞭毛体的凋亡状态，发现静止期 AG83 的 Annexin V 阳性比例显著高于 DD8。
- 通过流式细胞术对中性粒细胞 - 树突状细胞（N - DC）杂交体进行免疫表型分析：取全血样本，用多种荧光标记抗体染色，包括抗人 FITC 偶联的 CD66b、HLA - DR - PerCP、CD83 - PE 等，孵育后裂解红细胞，洗涤并重新悬浮细胞，在流式细胞仪上进行检测。
- 测定 PKDL 患者循环中诱导转分化的细胞因子和趋化因子：采用多重检测试剂盒，按照制造商的方案测定血浆中 TNF - α、IFN - γ 和 GM - CSF 的水平，使用 Luminex 200 Labmap 系统采集数据，并用 Bio - Plex Manager 软件进行分析。
- 量化中性粒细胞中的利什曼原虫感染：从健康供者外周血中分离中性粒细胞，采用 EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit 通过磁珠负选法获取高纯度中性粒细胞，确保细胞功能未被激活。用不同时间感染杜氏利什曼原虫前鞭毛体的中性粒细胞，提取 RNA 并逆转录为 cDNA，使用特异性引物通过 ddPCR 检测 A2 基因表达，以量化感染情况。
- 杜氏利什曼原虫对中性粒细胞的体外感染及中性粒细胞转分化状态：将中性粒细胞与杜氏利什曼原虫前鞭毛体（AG83 或 DD8）按 5:1 的比例孵育 2 小时，离心洗涤后，对细胞表面标记物（CD66b - FITC 和 CD83 - PE）进行染色，在流式细胞仪上检测转分化情况。
- 测量感染中性粒细胞中的 ROS：将感染或未感染的中性粒细胞与 CM - H2DCFDA 孵育，该探针可被细胞内酯酶水解并被 ROS 氧化产生荧光，通过流式细胞仪检测荧光强度，反映细胞内 ROS 水平。
- 测量感染中性粒细胞的吞噬潜能（CD44）：用 CD44 - APC - H7 对感染或未感染的中性粒细胞进行表面染色，孵育后洗涤并在流式细胞仪上检测，由于所有中性粒细胞均表达 CD44，因此检测其平均荧光强度（GMFC）来衡量吞噬潜能。
- Annexin - V 结合试验：按照制造商的建议，用 Annexin V - FITC 检测中性粒细胞凋亡。将感染后的中性粒细胞洗涤后重悬于结合缓冲液中，孵育后染色，在流式细胞仪上检测。同时，对杜氏利什曼原虫前鞭毛体也进行 Annexin V - FITC 和碘化丙啶（PI）双染，检测其凋亡情况。
- 金黄色葡萄球菌的标记和吞噬试验：制备不同浓度的 CFDA - SE 工作液，对金黄色葡萄球菌进行染色，优化标记条件。用毒力强的 AG83 或低毒力的 DD8 感染中性粒细胞后，再与 CFDA - SE 标记的金黄色葡萄球菌共孵育，洗涤后在流式细胞仪上检测，以 CFDA 荧光强度反映中性粒细胞的吞噬能力。
- 流式细胞术：根据中性粒细胞的前向和侧向散射特性进行形态学门控，以 CD66b 阳性确定中性粒细胞，以 CD66b+/CD83+双阳性确定 N - DCs。在流式细胞仪上采集 10,000 个细胞 / 管的数据，并用 BD FACS Suite 软件进行分析。为确保实验一致性，对样本处理的时间和条件进行了严格控制，且研究表明储存样本与新鲜样本中的中性粒细胞无显著差异。
- 统计分析：实验结果以中位数（四分位数间距，IQR）表示，使用 Student’s t - 检验（参数数据的非配对 t - 检验）、Mann Whitney t - 检验（两组非参数数据）或 Kruskal - Wallis 检验（多组非参数数据）进行统计分析，以 P < 0.05 为差异有统计学意义。
致谢
本研究得到了印度加尔各答 IPGME&R 的多学科研究单位（MRU）的技术支持，以及印度医学研究理事会（ICMR）和印度政府 JC Bose 奖学金的资助，资助机构在研究设计、数据收集与分析、论文发表决策和撰写过程中未发挥作用。
