精准狙击：优化检测方法，直击产 ESBLs 肺炎克雷伯菌复合群难题

本文聚焦产超广谱 β- 内酰胺酶（ESBL）的肺炎克雷伯菌复合群（KoC）检测。研究发现 VITEK 2 结合高级专家系统（AES）表现不佳，而 VITEK 2 联合临床实验室标准协会（CLSI）的 ESBL 检测更可靠。同时提出了优化的筛查临界值，有助于减少不必要检测。

　　

引言

肺炎克雷伯菌复合群（KoC）是引发多种感染的重要病原菌，尤其在医院环境中。该菌能产生染色体编码的 A 类 OXY 型 β- 内酰胺酶，其表达水平不同，对不同抗生素的水解能力也有差异。野生型（WT）OXY 低水平表达时使细菌对青霉素耐药，过表达则可水解部分超广谱 β- 内酰胺类药物。此外，KoC 还可能获得携带耐药基因（ARGs）的质粒，如超广谱 β- 内酰胺酶（ESBLs，主要是 CTX-M 型），导致耐药，严重限制治疗选择。因此，准确识别产 ESBL 的KoC（ESBL-KoC）至关重要，它不仅关乎患者治疗，还与医院感染防控密切相关。

传统的抗菌药物敏感性试验（AST）难以区分 ESBL-KoC 和高表达 OXY 的KoC（hOXY-KoC）。基于最低抑菌浓度（MIC）的 ESBL 确认试验（ESBL-CTs）由于 ESBL 和 OXY β- 内酰胺酶都能被克拉维酸（CL）抑制，存在高假阳性率。欧洲抗菌药物敏感性试验委员会（EUCAST）和临床实验室标准协会（CLSI）推荐的 ESBL 筛查临界值，对特定物种如KoC 的筛查效果不佳。VITEK 2 平台是一种常用的商业自动化 AST 系统，其配备的高级专家系统（AES）可辅助解读结果，但此前缺乏针对 VITEK 2/AES 检测 ESBL-KoC 能力的专门研究。本研究旨在评估 VITEK 2 在有无 AES 辅助下检测 ESBL-KoC 的能力，并分析特定抗生素的表型结果，提出更适合KoC 的筛查临界值。

材料和方法

1. 细菌菌株和鉴定：研究纳入 44 株非碳青霉烯酶产生的KoC 分离株，这些菌株来自人类和动物，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Bruker）常规鉴定，并进行全基因组测序（WGS），相关数据存入 NCBI GenBank 公共数据库（BioProject：PRJNA894995）。通过 WGS 确定菌株的物种、ARGs、质粒复制子类型、序列类型（ST），以及bla_OXYs及其启动子区域。同时，采用肉汤微量稀释（BMD）法（Sensititre 面板）进行 AST，根据 CRO 的 MIC 值和是否携带 ESBL 或质粒介导的 AmpC 基因（bla_pAmpCs）将菌株分为 hOXY-KoC。对 CRO MIC 升高的菌株，进一步用多种基于 CL 的 ESBL-CTs 检测，包括 BMD 试验、MIC 梯度条试验、EUCAST 推荐的联合纸片扩散试验（CDT）和双纸片协同试验（DDST），并以 ATCC 菌株作为质量控制。
2. VITEK 2 系统与 AES：在 IFIK 的临床微生物实验室，使用 VITEK AST-N242 卡和 VITEK 2 仪器对 44 株KoC 菌株进行检测，结果根据 EUCAST 标准解读，AES（版本 9.04.4）处于激活状态。从 MacConkey II 琼脂平板上挑取新鲜菌落，手动输入物种 ID（Ko）以启用 AES 分析表型，ATCC 菌株作为质量控制。若 AES 报告的 AST 结果与数据库表型 / MIC 分布不一致，或 CRO MIC 与 BMD 结果差异显著，则重复 VITEK AST-N242 卡检测。
3. VITEK 2 系统不使用 AES：IFIK 将 44 株编码的KoC 菌株用拭子和运输培养基送至 Alberta Precision Laboratories（APL）。在 APL，使用 VITEK AST-N390 卡和 VITEK 2 仪器进行 AST，结果根据 CLSI 标准解读，未常规使用 AES。对于 VITEK 2 检测 CRO 和 / 或 CAZ MIC >1 μg/mL 的菌株，在 MH 琼脂平板上用 CLSI 推荐的 CTX/CTX-CL 和 CAZ/CAZ-CL CDTs 检测 ESBL，ATCC 菌株作为质量控制。
4. 纸片扩散试验：在 IFIK，对 CRO、CPD、CAZ、CTX 和 ATM 进行纸片扩散分析，每种抗生素重复两次。在 APL，对 CAZ、CTX 和 ATM 进行单次纸片扩散试验。
5. 统计分析：以 WGS 结果为参考，计算所有 ESBL-CTs 和 VITEK 2 结果的敏感性（Se）、特异性（Sp）、阳性预测值（PPV）和阴性预测值（NPV）。对可能作为替代筛查临界值的 MIC 和抑菌圈直径也进行相应计算。

结果与讨论

1. KoC 菌株的特征：44 株KoC 菌株包括 11 株 CTX-M-1/-15 生产者、21 株 hOXY 和 12 株 WT。部分 hOXY-KoC 分离株产生能高效水解 CAZ 的 OXY 酶变体，呈现出类似 ESBL 的活性谱。本研究菌株数量和特征明确，为分析提供了有力支持。
2. VITEK 2 系统与 AES：VITEK 2 结合 AES 能正确识别所有 11 株 ESBL-KoC 菌株，但几乎所有 hOXY-KoC（19/21；90.5%）被误判为 ESBL 生产者，导致特异性仅为 64.7%。这可能是由于 AES 数据库未涵盖当前KoC 菌株产生的 OXY 酶特征，或 EUCAST 标准影响了 AES 对KoC 菌株的解读算法。鉴于此，建议在检测临床重要的KoC 分离株时禁用 AES，后续用 ESBL-CTs（如 CDTs）检测可疑菌株。
3. VITEK 2 系统不使用 AES：APL 对 44 株菌株进行 VITEK 2 ASTs，对 CRO 和 / 或 CAZ MIC >1 μg/mL 的菌株进行 CLSI CDTs，该方法检测 ESBL 生产者的敏感性为 100%，特异性为 95.7%，优于 VITEK 2/AES。然而，现行的 CRO 和 / 或 CAZ MIC >1 μg/mL 的筛查临界值会导致对KoC 菌株进行大量不必要的 ESBL-CTs。此外，CLSI 推荐的 CAZ/CAZ-CL CDT 性能不如 EUCAST 推荐的试验。
4. 进行 ESBL-CTs 的筛查临界值：为减少临床实验室对KoC 分离株不必要的 ESBL-CTs 使用，分析了 CRO、CPD、CAZ、CTX 和 ATM 的 MIC 及纸片扩散结果，根据数据提出了针对KoC 菌株进行 ESBL-CTs 的替代筛查临界值。这些临界值在保证 100% 敏感性的同时，提高了特异性和阳性预测值，并考虑了 BMD 和 VITEK 2 方法的差异以及避免主观读数差异。
5. 使用 CRO 的筛查临界值：现行 CRO EUCAST/CLSI 临界值（MIC >1 μg/mL）敏感性虽为 100%，但特异性和阳性预测值较低。综合考虑，建议KoC 菌株的 CRO MIC ESBL 筛查临界值设为 > 4 μg/mL，纸片扩散法临界值设为≤16 mm，这样能保证较高敏感性，同时减少不必要的 ESBL-CTs。
6. 使用 CPD 的筛查临界值：EUCAST 和 CLSI 对 CPD 的 MIC 筛查临界值不同，现有临界值特异性和阳性预测值较低。建议KoC 菌株的 CPD ESBL 筛查临界值为 > 4 μg/mL，纸片扩散法临界值为≤10 mm，可提高检测性能并减少不必要检测。
7. 使用 CAZ 的筛查临界值：CAZ 曾被认为可区分 ESBL-KoC 和 hOXY-KoC，但研究发现其不能有效区分。现行 CAZ EUCAST/CLSI 临界值（MIC >1 μg/mL）在 BMD 法中表现良好，但在 VITEK 卡检测中效果不佳。建议 EUCAST 和 CLSI 的 CAZ 纸片筛查临界值分别为≤22 mm 和≤30 mm，但 CLSI 的 30 μg 纸片检测性能相对较差。
8. 使用 CTX 的筛查临界值：CTX 是常用的 ESBL 筛查底物，但 VITEK 卡未检测该底物。BMD 法中，将 CTX MIC 临界值提高到 > 4 μg/mL 可提升特异性和阳性预测值。EUCAST 和 CLSI 的 CTX 纸片筛查临界值分别建议调整为≤12 mm 和≤22 mm，以优化检测效果。
9. 使用 ATM 的筛查临界值：ATM 未在本研究的 VITEK 卡中检测，BMD 法和纸片扩散法的现有临界值筛查性能均不佳。建议 MIC 筛查临界值仍为 > 1 μg/mL，纸片扩散法临界值为≤28 mm，但总体不推荐使用 ATM 进行KoC 菌株的 ESBL 筛查。
10. 结论：VITEK 2 配备 AES 检测效果不佳，而 VITEK 2 联合 CLSI 的 ESBL 筛查和确认试验是区分 ESBL-KoC 和 hOXY-KoC 的可靠方法。为减少不必要的 ESBL-CTs，本研究修订了多种抗生素的筛查临界值，这些临界值在本研究菌株中表现良好，但由于样本量有限，需用更大规模、特征更明确的KoC 菌株集合进行验证。