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本文研究发现 DEAD-box RNA 解旋酶 10（DDX10）可通过与猪圆环病毒 3 型（PCV3）衣壳蛋白相互作用并激活干扰素（IFN）反应来抑制 PCV3 复制。该研究为 PCV3 感染的防控提供了重要靶点，对理解病毒致病机制意义重大。
PCV3 感染降低 RNA 解旋酶 DDX10 的表达
猪圆环病毒 3 型（PCV3）是一种新出现的病原体，能引发猪的多种病症，造成严重经济损失。此前研究发现 PCV3 衣壳（Cap）蛋白与 DEAD-box RNA 解旋酶 10（DDX10）相互作用，但这种相互作用对病毒复制的调控机制尚不明确 。
研究人员为探究 PCV3 感染过程中 DDX10 的表达变化，用 PCV3 以感染复数（MOI）为 1 感染不同细胞类型，通过蛋白质免疫印迹（Western blotting）和实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）分析内源性 DDX10 的表达动力学。结果显示，PCV3 感染 PK-15 细胞后，在 12、24、36 和 48 小时（hpi），DDX10 的蛋白质水平显著下降，mRNA 水平也在相应时间点明显降低。在 PCV3 感染的 3D4/21 细胞中也观察到类似结果，且这种下调呈剂量依赖性，表明 PCV3 感染会降低 RNA 解旋酶 DDX10 的蛋白质和转录水平。
DDX10 表达抑制 PCV3 复制
为研究 DDX10 在 PCV3 感染中的作用，研究人员构建了 DDX10 过表达细胞系，用 PCV3 以 MOI 为 1 感染这些细胞，通过检测复制酶（Rep）蛋白表达水平和病毒滴度评估病毒复制情况。结果发现，DDX10 过表达细胞中 Rep 蛋白表达显著低于 PCV3 感染的空载体细胞，PCV3 在 DDX10 过表达细胞中的复制能力比对照细胞低约 10 倍，说明 PCV3 复制在 DDX10 过表达细胞中受到抑制。
为进一步验证，研究人员利用针对 DDX10 的小干扰 RNA（siRNA）降低 DDX10 蛋白水平，再用 PCV3 感染细胞。结果显示，DDX10 沉默的细胞中 PCV3 的 Rep 表达水平和病毒子代产量均显著增加，表明沉默 DDX10 可促进 PCV3 复制。综合这些结果，表明 DDX10 能抑制 PCV3 复制。
PCV3 Cap 与 DDX10 共定位并直接相互作用
为深入研究 PCV3 Cap 与 DDX10 的关系，研究人员通过共聚焦显微镜观察它们在细胞内的分布。在 PK-15 细胞和 HEK293T 细胞中，共转染 GFP-DDX10 和 mCherry-PCV3-Cap 后，发现 DDX10 与 PCV3 Cap 共定位，且与核仁蛋白核仁素（NCL）也存在重叠，免疫荧光实验表明 PCV3 Cap 和 DDX10 都是核仁定位蛋白。
通过免疫沉淀实验，研究人员发现 PCV3 Cap 能与内源性 DDX10 蛋白相互作用。在 HEK293T 细胞中进行的共免疫沉淀实验进一步验证了 DDX10 与 PCV3 Cap 的相互作用，且发现 PCV1、PCV2 和 PCV4 的 Cap 蛋白也能与 DDX10 相互作用。谷胱甘肽 - S - 转移酶（GST）下拉实验表明 PCV3 Cap 能直接与 DDX10 结合，证明 PCV3 Cap 与 DDX10 共定位并直接相互作用。
PCV3 Cap 的 NLS 对与 DDX10 的相互作用至关重要
为确定 PCV3 Cap 与 DDX10 相互作用的关键结构域，研究人员构建了两个截断的 PCV3 Cap 构建体。共免疫沉淀（co-IP）实验显示，PCV3 Cap 和含有核定位信号（NLS）的 Cap-NLS 能与 DDX10 相互作用，而缺失 NLS 的 PCV3 Cap-ΔNLS 则不能，表明 PCV3 Cap 的 NLS 是与 DDX10 结合的关键结构域。
研究人员对 PCV1、PCV2、PCV3 和 PCV4 Cap 蛋白的 NLS 进行研究，发现它们的 NLS 对于与 DDX10 的结合都是必需的。进一步研究不同物种圆环病毒 Cap 蛋白的 NLS，发现它们与 DDX10 的相互作用都依赖于 NLS，且 Cap NLS 序列和关键氨基酸位点在进化上高度保守，说明圆环病毒 Cap NLS 在与 DDX10 的相互作用中具有重要且保守的作用。
DDX10 中央解旋酶结构域与 Cap 的结合对调节 PCV3 复制至关重要
DDX10 具有 N 端结构域、中央解旋酶结构域和 C 端结构域。研究人员构建了七个 DDX10 截断突变体，通过 co-IP 实验发现，含有解旋酶结构域的 DDX10 突变体（DDX10 - 螺旋酶、DDX10-NTD - 螺旋酶和 DDX10 - 螺旋酶 - CTD）能与 PCV3 Cap 相互作用，而不含解旋酶结构域的突变体（DDX10-NTD、DDX10-CTD 和 DDX10-NTD - CTD）则不能，表明 DDX10 的解旋酶结构域对与 PCV3 Cap 的结合至关重要。
为评估 DDX10 中央解旋酶结构域与 Cap 的结合对 PCV3 复制的影响，研究人员用表达不同 DDX10 变体的质粒转染 PK-15 细胞，再用 PCV3 感染。结果显示，转染 DDX10-WT 或 DDX10-M2（含有解旋酶结构域）的细胞中，Rep 蛋白水平和病毒滴度显著低于转染空载体或 DDX10-M6（不含解旋酶结构域）的细胞，表明 DDX10 中央解旋酶结构域与 Cap 的结合对 PCV3 复制至关重要，且该中央解旋酶结构域在进化上高度保守。
DDX10 通过促进 IFN-β 产生和 ISG 表达抑制 PCV3 复制
DDX 家族蛋白的抗病毒活性主要通过调节 IFN-β 产生或与病毒蛋白相互作用实现。研究人员在 PCV3 感染的 3D4/21 细胞中研究猪 DDX10 对 IFN-β 产生的影响，转染不同 DDX10 变体的质粒后感染 PCV3，检测 IFN-β 的 mRNA 水平。结果显示，DDX10-WT 或 DDX10 - 螺旋酶 - M2 过表达显著上调 IFN-β 的 mRNA 水平，而空载体或 DDX10-M6 过表达则无此效果。
由于 IFN-β 的抗病毒作用主要通过诱导许多干扰素刺激基因（ISG）实现，研究人员进一步检测 ISG 的表达。发现 DDX10-WT 或 DDX10-M2 过表达能上调 MX1、MX2、OAS1 和 ISG15 的 mRNA 表达，且增加 p-TBK1 和 p-IRF3 蛋白表达水平。而 DDX10 敲低则下调这些基因的表达和蛋白水平。在 IRF3 基因敲除的 3D4/21 细胞中，DDX10 过表达不能显著下调 Rep 蛋白水平和病毒滴度，表明 IFN-β 的诱导对 DDX10 的抗 PCV3 活性是必需的，说明 DDX10 的抗 PCV3 活性与诱导 IFN-β 产生和 ISG 表达有关，而 PCV3 Cap 则对抗其抗病毒活性。
研究总结
本研究表明 DDX10 表达通过促进 IFN-β 产生和 ISG 表达抑制 PCV3 复制，PCV3 感染则下调 DDX10 表达以对抗其抗病毒作用，揭示了 PCV3 感染的一种新的免疫逃避策略。虽然确定了 DDX10 与 PCV3 Cap 相互作用及调节病毒复制的关键结构域，但 DDX10 是否与 cGAS-STING 介导的先天信号轴相互作用以及如何激活 IFN-β 产生等问题仍需进一步研究，这将有助于更深入理解 PCV3 的致病机制和防控策略。
