地塞米松通过激活钠氢交换体 3 破坏细胞内 pH 稳态，延缓冠状病毒感染性支气管炎病毒进入细胞 —— 为抗冠状病毒药物研发提供新策略

这篇研究发现地塞米松（Dex）可激活钠氢交换体 3（NHE3），破坏细胞内 pH 稳态，抑制冠状病毒感染性支气管炎病毒（IBV）的复制。其抗病毒效果与病毒、细胞类型相关，且依赖 GR 和 NHE3 活性。该研究为抗冠状病毒药物研发奠定了基础。

　　

引言

冠状病毒进入宿主细胞是其复制周期和逃避宿主免疫反应的关键环节。多数冠状病毒进入细胞的过程对内体 / 溶酶体 pH 敏感，酸性 pH 可触发刺突（S）蛋白构象变化，促进病毒基因组 RNA 释放到细胞质中启动复制。

钠氢交换体（NHEs）在维持内体质子平衡中起重要作用，与 V-ATPase 协同促进内体酸化和成熟。NHE3 作为 NHE 的一种亚型，对细胞受体介导的内吞作用、内体酸化和维持细胞质 pH 稳态有显著影响。

目前，内体腔 pH 与冠状病毒进入之间的因果关系尚不清楚，NHE3 介导的精确调节内体腔 pH 的质子泄漏途径以及与冠状病毒进入的关系也有待研究。地塞米松（Dex）已被证实可降低新冠患者死亡率，但对其抗病毒机制的研究尚不充分。本研究旨在探讨 Dex 对冠状病毒感染性支气管炎病毒（IBV）复制的影响及其潜在机制，为开发新型抗病毒药物提供理论依据。

结果

1. Dex 抑制 IBV 复制呈剂量依赖性：用 Dex 处理感染 IBV 的 DF-1 和 H1299 细胞，通过定量 PCR（qPCR）和免疫荧光测定发现，Dex 显著抑制 IBV 复制，且随着 Dex 浓度增加，抑制作用增强。
2. Dex 抗病毒活性与病毒和细胞类型相关：研究发现，Dex 对不同病毒（如 IBV、单纯疱疹病毒（HSV）、水泡性口炎病毒（VSV）等）的复制抑制效果不同，对同一病毒在不同细胞系（如 DF-1、H1299、Vero 细胞）中的抗病毒效果也存在差异，表明 Dex 抗病毒特性具有选择性，与特定病毒株和宿主细胞密切相关。
3. Dex 阻断 IBV 负链基因组 RNA 合成起始，影响后续病毒翻译：在 IBV 感染早期（0 - 6 hpi），检测发现 Dex 处理后，IBV-N mRNA 水平在 3 hpi 后显著受到抑制，4 hpi 时 IBV 负链基因组 RNA 合成被阻断，且 Dex 对 IBV 结构和非结构蛋白翻译的抑制呈剂量依赖性，说明 Dex 主要在 IBV 内吞后的复制阶段发挥抑制作用，不影响病毒吸附和内吞。
4. Dex 影响内溶酶体酸性环境，阻断货物向溶酶体运输：利用 DQ-Red BSA 转运试验和 pH 敏感探针 Protonex Red 600 检测发现，Dex 处理后，细胞内溶酶体酸性环境被破坏，导致 DQ-Red BSA 蛋白水解受损，内体和溶酶体腔 pH 升高，从而抑制 IBV 向溶酶体运输，阻碍病毒复制。
5. Dex 将 IBV 限制在晚期内体：通过免疫荧光检测发现，Dex 显著增强了 IBV-N 蛋白与晚期内体（Rab7）的共定位，而与早期内体（Rab5）和溶酶体（Lamp1）的共定位基本不受影响，表明 Dex 可能将 IBV 限制在晚期内体，阻止病毒进一步感染。
6. Dex 介导的抗病毒作用依赖 GR 和 NHE3 活性：使用 GR 拮抗剂 RU486、NHE3 特异性抑制剂 tenapanor 等处理细胞后发现，Dex 介导的抗病毒作用可被 RU486 和 tenapanor 缓解，且 tenapanor 在特定浓度下可逆转 Dex 对 IBV 的抑制作用，说明 Dex 的抗病毒效果依赖于 GR 和 NHE3 的活性。
7. Dex 和 tenapanor 通过调节 NHE3 显著影响细胞内 pH，抑制 IBV 复制：采用膜片钳技术和 BCECF-AM 探针检测发现，Dex 激活 NHE3，使细胞内 pH 升高；tenapanor 抑制 NHE3，使细胞内 pH 降低。通过流式细胞术和荧光微孔板检测进一步证实，Dex 和 tenapanor 可调节细胞内 pH 稳态，且 Dex 对 Vero 细胞内 pH 影响不明显，这与 Dex 在 Vero 细胞中对 IBV 复制抑制作用有限的现象相符。
8. IBV 细胞进入受 pH 稳态显著影响：用 tenapanor 在 IBV 感染的不同阶段处理细胞，发现 tenapanor 在 IBV 脱壳前处理可显著抑制 DF-1 和 H1299 细胞中 IBV-N 蛋白产生和 mRNA 水平，且抑制作用呈剂量依赖性，但对 Vero 细胞中 IBV 感染影响较小，表明细胞内 pH 稳态对 IBV 复制至关重要，主要影响其进入细胞的步骤。
9. NHE3 对 IBV 复制至关重要，影响 S 蛋白裂解：通过 CRISPR-Cas9 技术构建 NHE3 基因敲除的 H1299 细胞系（NHE3^-/-），发现 NHE3 缺失显著抑制 IBV-N 蛋白表达和 S 蛋白裂解，说明 NHE3 对 IBV 复制必不可少。
10. NHE3 中 Ser663 磷酸化影响 IBV 复制：构建针对 NHE3 Ser663 的突变质粒，转染 H1299 细胞后感染 IBV，结果显示在 NHE3 野生型（WT）细胞中，NHE3 在 Ser663 处去磷酸化促进 IBV 复制，磷酸化则抑制复制；在 NHE3^-/-细胞中，NHE3 磷酸化对 IBV 复制无影响，且该位点磷酸化和去磷酸化对 H9N2 复制影响较小。
11. 降低细胞内 pH 促进禽流感病毒（AIV）复制：用 tenapanor 处理细胞后感染 AIV、新城疫病毒（NDV）和 VSV，发现 tenapanor 显著增强 H9N2 在 H1299 和 DF-1 细胞中的复制，对 NDV 和 VSV 复制影响较小。在 NHE3^-/- H1299 细胞中，H9N2 的 HA 和 M 基因 mRNA 水平显著升高，表明不同病毒对细胞内酸性环境（pH）的需求存在差异，H9N2 更倾向于在酸性细胞质环境中复制。

讨论

糖皮质激素（如 Dex）在抗病毒治疗中存在争议，其在降低新冠患者死亡率的同时，也可能带来不良反应，如增加病毒载量和易感性等，是一把双刃剑。

本研究表明，Dex 抑制 IBV 复制可能是通过阻断膜融合或病毒脱壳，抑制初始 IBV 负链基因组 RNA 合成。不同细胞对 Dex 处理的反应不同，导致其对 IBV 复制的抑制效果存在差异，如 Vero 细胞对 Dex 处理后细胞内 pH 变化不敏感，因此 Dex 对其 IBV 复制抑制作用不明显。

冠状病毒和流感病毒进入细胞均需要合适的细胞内 pH 环境，NHE3 在维持细胞内 pH 稳态和病毒感染过程中起关键作用。抑制 NHE3 活性会影响细胞内 pH，进而影响病毒复制，且 NHE3 磷酸化状态也与 IBV 复制相关。

Dex 在体内外对不同病毒的作用复杂，可能涉及细胞 pH、细胞因子风暴、免疫抑制和细胞黏液产生等多种因素。本研究发现 Dex 通过激活 NHE3 破坏细胞内 pH 稳态，延缓 IBV 细胞进入，为开发新型抗冠状病毒药物提供了潜在策略，即靶向 NHE3 活性调节细胞内 pH，有望在不损害免疫功能的前提下对抗冠状病毒感染。

结论

NHE3 活性对细胞内 pH 稳态至关重要，而细胞内 pH 稳态对于冠状病毒的膜融合和脱壳不可或缺。开发选择性调节 pH 的药物，靶向 NHE3 活性增强质膜与内体之间的质子泄漏途径，可能是对抗冠状病毒早期感染的有效策略。

材料和方法

1. 细胞和病毒：实验所用 DF-1、H1299、Vero 等多种细胞系分别来源于美国典型培养物保藏中心（ATCC）或由相关研究人员提供。细胞培养采用相应培养基并添加 10% 胎牛血清（FBS），在 37°C、5% CO₂条件下培养。实验使用的 IBV、VSV、AIV、NDV 等病毒株分别保存于上海兽医研究所等机构。
2. 化学试剂：实验所用多种化学试剂，如细胞内 pH 校准缓冲试剂盒、NHE3 特异性抑制剂 tenapanor 等，均购自相应商业公司。
3. 蛋白质免疫印迹（Western blotting）和抗体：细胞在指定感染时间收获，经处理后进行 SDS-PAGE 分离蛋白，再转至 PVDF 膜，依次进行封闭、孵育一抗、二抗，最后用化学发光检测系统显色。实验使用了多种自制和购买的抗体用于检测不同蛋白。
4. 免疫荧光：DF-1 和 H1299 细胞感染 IBV 后，在指定时间固定、通透、封闭，孵育一抗、二抗，用 DAPI 染色细胞核，最后在共聚焦显微镜下观察并通过 ImageJ 软件分析图像。
5. RNA 提取和逆转录定量 PCR（RT-qPCR）：采用 RNeasy Mini Kit 提取 RNA，按照实验室建立的方法进行 qRT-PCR 检测病毒 RNA，实验中使用了针对不同病毒基因的特异性引物，通过标准曲线计算病毒 RNA 含量。
6. 细胞质 pH 检测：使用 pHrodo Red AM 作为细胞内 pH 指示剂，通过与细胞内 pH 校准缓冲试剂盒配合使用，创建标准曲线，计算细胞内绝对 pH 值。同时，利用 BCECF-AM 荧光指示剂检测 Dex 和 tenapanor 处理后细胞内 pH 变化及 NHE 活性变化。
7. 细胞活力测定：采用 CCK-8 法测定细胞活力。
8. 统计分析：实验数据为至少三次独立实验的平均值，使用 GraphPad Prism 软件 9.0 进行统计分析，数据以平均值 ± 标准误表示，通过非配对 Student's t 检验判断统计学意义，P<0.05 为差异有统计学意义。