独特真皮细菌特征：区分特应性皮炎皮肤与健康皮肤的关键标识

这篇研究聚焦特应性皮炎（AD），通过对 37 位 AD 患者和 37 位健康对照者皮肤不同层微生物群的研究发现，AD 对皮肤微生物群影响在真皮更显著。真皮细菌群落独特，或可用于监测疾病、分类患者，为 AD 治疗开辟新思路。

　　

引言

人体皮肤栖息着大量微生物，其组成在皮肤层和不同栖息地存在差异，这受局部微环境影响。微生物群落对维持皮肤健康、调节皮肤疾病发展意义重大，微生物失调与慢性皮肤炎症相关，比如特应性皮炎（AD）。在中重度 AD 中，微生物失调主要由金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）增殖和皮肤共生菌减少引发，但二者间因果关系不明，清除金黄色葡萄球菌对改善 AD 效果不佳，这表明皮肤健康可能取决于多种微生物组成的群落。

过往多数皮肤微生物研究集中于表皮，采用皮肤拭子等浅表采样方法。而真皮的微生物群与表皮不同，且在健康个体间更相似，受宿主 - 微生物相互作用影响，不易受外界污染。探究真皮微生物群的分类和功能变化，有助于深入了解微生物在 AD 发病机制中的作用。

本研究旨在确定真皮或表皮微生物群落能否更好地区分 AD 患者和健康对照者，探究不同皮肤栖息地（干燥、湿润和皮脂腺）的微生物群组成与分布。研究采集了 AD 患者和健康个体常见湿疹易发部位的病变和非病变皮肤样本，运用多种方法进行分析。

结果

1. 浅层和深层细菌的可视化：皮肤微生物群在不同皮肤层分布不均。胶带剥离样本显示，在 AD 湿润（病变 / 非病变）和健康皮脂腺皮肤栖息地，细菌附着在角质形成细胞上，形成大的细菌聚集体（直径达 1500μm）；干燥皮肤栖息地细菌分布稀疏。皮肤切片中，微生物群以细菌聚集体（直径 10 - 15μm）和单个分散细菌细胞形式存在于角质层、毛囊漏斗部和毛囊内。病变皮肤的细菌聚集体比非病变皮肤更常见，湿润皮肤栖息地比干燥皮肤栖息地更频繁，不过总体聚集体分布在 AD 和健康皮肤中相似。严重病变的 AD 皮肤深层表皮有高代谢活性的细菌聚集体。
2. 从皮肤胶带剥离培养的表皮皮肤微生物群：无论胶带剥离层数、皮肤栖息地或病变严重程度，AD（病变和非病变）与健康对照（HC）皮肤的表皮微生物群落组成差异显著。AD 患者干燥和湿润皮肤栖息地的细菌菌落形成单位（CFUs）显著高于 HC，但皮脂腺皮肤栖息地（非病变）无差异。AD 表皮中金黄色葡萄球菌的流行率显著高于 HC，而痤疮丙酸杆菌（Cutibacterium acnes）则相反，表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）在所有皮肤样本中普遍存在，且阴性对照胶带无 CFUs 产生，排除了污染问题。
3. 使用 16S 扩增子测序分析 AD 和健康皮肤的真皮和表皮微生物群：研究发现病变状态（病变与非病变）和 AD 严重程度对 AD 样本中扩增子序列变异（ASV）丰富度和群落组成无显著影响，因此将 AD 样本（病变和非病变）合并与 HC 样本比较。分析表明 AD 状态、皮肤隔室（表皮与真皮）和皮肤栖息地（湿润与干燥）对群落组成和 ASV 丰富度有显著影响。进一步将样本分为四个皮肤组研究发现，AD 对四个皮肤组的细菌组成均有显著影响，在湿润真皮皮肤组影响稍高。干燥真皮中，AD 患者的丰富度显著高于 HC，其他皮肤组无此差异。AD 和 HC 皮肤以及 AD 表皮和真皮隔室的微生物谱存在差异，如葡萄球菌属（Staphylococcus）、棒状杆菌属（Corynebacterium）和丙酸杆菌属（Cutibacterium）等属变化明显。真皮群落能更好地识别 AD 和 HC 皮肤间显著变化的属，如普雷沃菌属（Prevotella）和光岗菌属（Mitsuokella）在真皮中有显著差异，表皮无变化。此外，在湿润真皮皮肤组发现两种与 AD 相关的 ASV 在多重比较校正后仍显著差异。
4. 功能分析：由于鸟枪宏基因组学获得的微生物衍生读数少，研究使用代谢条形码数据注释基因通路。结果显示，与分类学比较，皮肤细菌功能谱差异显著。湿润栖息地和真皮群落中，AD 和 HC 皮肤的功能能力差异更大。干燥栖息地中，表皮无显著差异通路，真皮有 14 条；湿润栖息地中，表皮和真皮分别有 25 条和 61 条。多个皮肤组中，10 条通路表达差异显著，其中 7 条与甲萘醌（维生素 K2）生物合成相关，在 AD 皮肤中表达更高；还有与乳糖和半乳糖降解、NAD 生物合成相关的通路，分别在 AD 和 HC 皮肤中高表达。

讨论

本研究将皮肤活检分为不同隔室进行研究，揭示了 AD 相对于健康皮肤独特的微生物群。研究发现 AD 对真皮样本微生物群影响更明显，真皮样本可避免瞬态微生物干扰，更准确反映 AD 进展与微生物组成的关系。真皮微生物群在不同栖息地更保守，受宿主免疫反应和局部微环境影响，能更好地体现 AD 的生物学机制；表皮微生物群受多种因素影响，反映个体差异和生活方式，二者在 AD 研究中相辅相成。

研究观察到 AD 与皮肤细菌在群落组成和功能上广泛相关。例如，葡萄球菌属和链球菌属（Streptococcus）在 AD 皮肤中丰度和 ASV 丰富度增加；普雷沃菌属在 AD 和 HC 真皮中差异显著，且与其他皮肤疾病相关；光岗菌属在 AD 真皮中显著减少，此前未与 AD 皮肤关联。此外，研究还发现 AD 和 HC 皮肤微生物通路存在显著差异，如甲萘醌生物合成、NAD 生物合成、乳糖和半乳糖代谢等通路变化，这些变化可能与 AD 发病机制相关。

表皮微生物群培养显示 AD 群落变化显著，与 16S rRNA 扩增子代谢条形码结果互补，表明关键分类群的物种和菌株水平变异与 AD 相关，且 AD 皮肤微生物群落整体相对稳定，这可能与皮肤病理生理状况有关。在 AD 患者中，痤疮丙酸杆菌在皮脂腺皮肤的主导地位被其他菌属取代，但总 CFUs 无显著差异，提示环境饱和。

研究还证实了细菌聚集体在皮肤的存在，以及 AD 皮肤微生物穿透深度与病变严重程度的关系，轻度至中度 AD 的角质层增厚可能有助于保护皮肤。在研究方法上，本研究强调了多种数据集结合的价值，同时指出培养法和代谢条形码的局限性，鸟枪宏基因组学也因宿主 DNA 主导难以获得足够微生物读数。未来研究可采用长读长扩增子测序等新技术，增加样本量并延长洗脱期，以减少干扰因素。

以往 AD 研究多关注表皮，而本研究表明表皮症状可能是真皮深层相互作用的表面反映，针对真皮的研究有望为 AD 治疗带来新突破。

结论

研究证实 AD 与健康表皮皮肤的微生物组成存在显著差异，AD 中葡萄球菌属增多，丙酸杆菌属减少。AD 对真皮和表皮微生物群均有影响，但在真皮中更明显，真皮细菌群落分类上更保守，有助于区分 AD 核心微生物群。此外，AD 和健康皮肤的细菌功能谱在真皮差异更大。未来研究应综合考虑所有皮肤层微生物群，减少表皮分类群干扰，以更好地细分患者类型，改善个性化治疗。

材料和方法

1. 研究地点：样本在 Herlev - Gentofte 医院皮肤科和过敏科采集，样本处理和数据分析在哥本哈根大学免疫学和微生物学系、地理遗传学系以及 Rigshospitalet 医院临床微生物学系进行。
2. 参与者和采样：招募符合诊断标准的 AD 患者和健康对照者，设定了纳入和排除标准。最终纳入 37 名 AD 患者（男：女 = 17：20，平均年龄 34 岁）和 37 名年龄、性别匹配的健康对照者。采集样本包括从部分参与者特定部位收集 16 层胶带剥离样本，以及从所有参与者肘部和手背采集的皮肤活检样本，活检样本一部分固定，一部分分为真皮和表皮隔室保存。
3. 培养和细菌鉴定：将胶带剥离样本处理后进行培养，在不同条件下培养 1 - 3 天，对菌落进行计数、分离和保存。使用基质辅助激光解吸 / 电离 - 飞行时间质谱（MALDI - TOF ms）鉴定细菌分离物，依据 ID 评分判断鉴定结果。
4. 染色和共聚焦显微镜：对特定胶带剥离样本和皮肤组织切片进行染色处理，使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察，设定不同激发和发射波长，对图像进行处理和半定量分析。
5. 扩增子和鸟枪宏基因组学：提取皮肤活检样本 DNA，进行 PCR 扩增、文库制备和代谢条形码分析，部分样本进行鸟枪宏基因组学测序，但因微生物读数少，后续功能分析主要基于 16S rRNA 数据。
6. 生物信息学和统计学：使用 DADA2 处理测序数据，去除污染序列，进行质量过滤、错误校正等操作，使用 Tax4Fun2 预测细菌群落功能。采用多种统计方法分析数据，使用 R 和 Prism 9.3 软件进行计算和绘图。

致谢

本研究由 Leo Foundation 资助，同时感谢 Naireen Fatima 在 MALDI - TOF MS 分析中的协助。