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本文聚焦结直肠癌（CRC），发现转录因子 TBX3 在 CRC 中异常表达。它与 Wnt/β-catenin 转录复合物相互作用，调控转移相关基因。这一发现为 CRC 治疗提供潜在靶点，有望突破现有治疗困境，极具研究价值。
TBX3 在人类结直肠癌细胞中的表达
Wnt/β-catenin 信号通路在胚胎发育和成人干细胞稳态中起着关键作用，其异常激活与多种疾病相关，尤其是结直肠癌（CRC）。然而，由于该通路在成人体内广泛活跃且难以找到合适分子靶点，针对它的治疗干预颇具挑战。
研究人员此前发现发育转录因子 TBX3 参与小鼠前肢发育中 Wnt 介导的转录调控。在本研究中，通过对患者来源的癌细胞系进行基因表达分析，发现 TBX3 在多种内胚层和中胚层起源的肿瘤中表达，在胃肠道和肝脏肿瘤中尤为突出。其表达与部分 Wnt 靶基因（如 AXIN2、LGR5）部分重叠，且在 TBX 转录因子家族中表达水平最高。
单细胞 RNA 测序（scRNAseq）进一步证实，TBX3 在约 26.4% 的肿瘤细胞中表达，其表达量与相关 Wnt 靶基因、Wnt/β-catenin 信号通路组件基因以及间充质转移标记基因相关。在 LGR5+细胞区室中也检测到 TBX3 表达，表明它可能在肠上皮干细胞或癌干细胞中发挥作用。
TBX3 在人类结直肠癌细胞中的全基因组染色质结合
为探究 TBX3 作为基因表达调节因子的活性，研究人员在具有 β-catenin 激活突变、Wnt 信号通路持续激活的 HCT116 结直肠癌细胞系中，采用 CUT&RUN（C&R）的 Low-Volume 和 Urea（LoV-U）方法，并进行 25 次实验重复，通过 ICEBERG 方法确定 TBX3 的全基因组结合位点。
实验发现，所有重复实验均成功，不仅在已知的 TBX3 靶基因（如 WNT9A）处显示出高信号峰，还鉴定出未知的结合区域，如与侵袭性家族性 CRC 相关的原癌基因 MET。共获得 9775 个高可信度峰，这些峰主要位于基因间区域（约 38%）和内含子（约 53%），启动子区域较少（约 5%）。
对 TBX3 结合位点的 DNA 序列进行基序 / 共识分析，发现多种转录因子特征，但未发现 TBX 共识序列，这表明 TBX3 可能作为辅助因子劫持预组装的转录复合物，而非直接结合 DNA。在其他携带 APC 功能缺失等位基因的 CRC 细胞系（如 DLD1 和 SW620）中进行类似实验，也观察到 TBX3 信号的富集，说明该研究结果代表了 TBX3 在人类 CRC 中的一般基因组活性。
TBX3 与 Wnt 信号介导因子 β-catenin 的结合谱重叠
基于之前在小鼠胚胎前肢中的研究及本次实验结果，研究人员推测 TBX3 可能在 CRC 细胞中与 β-catenin 协同作用。通过测量 TBX3 和 β-catenin 的 ICEBERG 峰重叠情况，发现 53% 的 TBX3 结合位点也被 β-catenin 结合，表明二者在 CRC 细胞中有很强的协同作用。
对 TBX3 和 β-catenin 结合区域的基因组注释显示，二者结合区域多位于基因间和内含子区域，且无明显差异。TBX3 单独结合的峰富集 Jun/AP1 家族因子，而二者共同结合的峰则富集 Wnt 信号转录因子 LEF1。KEGG 通路分析表明，共同结合峰相关基因集富集于细胞迁移、增殖相关的生物学过程，如肌动蛋白细胞骨架重塑、粘着斑以及 Hippo、Ras 和 Wnt 信号通路，暗示 TBX3 参与 CRC 中这些基因的直接调控。
此外，在肝癌（HCC）细胞系和患者活检样本中，也发现 TBX3 和 β-catenin 在相关致癌基因（如 MYC、RAS 和 STAT1）上的基因组占用重叠，说明这种合作可能是 Wnt 驱动癌症的普遍特征。
TBX3 对结直肠癌细胞转移相关基因的调控
TBX3 的全基因组结合谱表明它可能直接调控与转移行为相关的基因。此前研究发现，在 HCT116 细胞中过表达 TBX3 可增强其体内转移能力，且 TBX3 过表达与 CRC 预后不良相关。
为进一步探究 TBX3 与转移行为的关系，研究人员采用 Cap-Analysis Gene Expression 测序（CAGE-seq）测量 TBX3 过表达时 HCT116 细胞中基因转录变化。结果显示，与对照空载体（EV）相比，共有 155 个差异表达转录本，其中 129 个上调，26 个下调，表明 TBX3 在该环境中主要介导基因激活。
通过整合 TBX3 基因组分布与 HCT116 中 H3K27ac 标记的开放染色质 HiChIP 数据，发现差异表达的 CAGE-seq 区域与 H3K27ac 介导的 DNA - DNA 相互作用环相关，且大部分与 TBX3 和 β-catenin 共同结合区域相关，说明二者共同促进差异 RNA 产生。KEGG 通路富集分析发现，TBX3/β-catenin 调控的基因高度富集于癌症相关过程，包括与结直肠肿瘤预后相关的 S100 基因家族和已知的侵袭转移介质 EZR 等基因。
为验证直接靶点，研究人员设计 sgRNAs 敲低 HCT116 细胞中 TBX3 表达，导致 TBX3 mRNA 减少 75%，同时 AXIN2 及其他 CRC 转移相关基因下调。与 TCF7L2 敲除的 HCT116 细胞 RNA 测序数据对比，发现 TBX3 靶点表达趋势相似，支持 TBX3 与 Wnt 转录机制协同调节基因的观点，但不能排除其他 TCF/LEF 因子的影响。
TBX3 与 Wnt/β-catenin 转录复合物的物理关联
由于在 TBX3 结合位点未发现 TBX 共识序列，研究人员推测它可能通过劫持其他染色质相关蛋白复合物发挥作用。为此，选择 Wnt 响应的 HEK293T 细胞，利用 BioID 技术，通过调节 Wnt/β-catenin 信号通路（用 CHIR99021 激活，LGK974 抑制），绘制 TBX3 在不同条件下的物理邻近蛋白图谱。
结果发现，在 CHIR 处理的细胞中鉴定出 191 个候选相互作用蛋白，在 LGK 处理的细胞中鉴定出 462 个。CHIR 激活 Wnt 信号通路增强了 TBX3 与多种已知 Wnt 信号相关基因表达调节蛋白（如 SMARCA4、SMARCA5、DDX3X、TRRAP 和 β-catenin）的邻近性，而在 LGK 抑制条件下，部分相互作用减少，但仍存在，除了与 β-catenin 的相互作用。这些结果支持 TBX3 在 Wnt 通路激活时通过与 Wnt/β-catenin 转录复合物成员的直接和广泛物理接触，与 Wnt 响应元件（WREs）结合的模型。
保守三氨基酸基序介导 TBX3 与 Wnt/β-catenin 转录复合物的相互作用
对 TBX3 氨基酸序列分析发现，在其 DNA 结合 T-box 结构域边缘存在一个 Asn-Pro-Phe（NPF）基序。该基序在进化上高度保守，且与 Wnt 辅助因子 Pygopus 的反式激活结构域相似，参与其与 Wnt/β-catenin 转录复合物的相互作用。此外，研究还考虑了另一个三氨基酸基序 RRM（arginine–arginine–methionine），它是 TBX3 DNA 结合结构域的组成部分。
结构上，NPF 和 RRM 位于 T-box 结构域相对位置，均可与 DNA 形成相互作用，但 NPF 更暴露，可能作为其他蛋白质的对接位点。通过 AlphaFold2 和 AlphaFold3 预测发现，删除 NPF 或 RRM 会导致局部结构扰动，但不影响整体蛋白折叠，且 AlphaFold3 无法预测 TBX3 与含有 LEF1 或 Jun/AP1 共识序列的 DNA 的相互作用，支持 TBX3 通过蛋白 - 蛋白相互作用而非 DNA 结合发挥作用的观点。
实验方面，构建缺失 NPF 或 RRM 的 TBX3 突变体（TBX3?NPF 和 TBX3?RRM）进行 BioID 实验，发现两种突变均导致显著相互作用蛋白数量大幅减少，且在 Wnt 通路激活时，TBX3 不再与 β-catenin 及其他相关蛋白邻近。采用 SuperTOPFlash 报告基因实验检测转录活性，发现 TBX3-WT 可在 Wnt 通路刺激下显著增强报告基因转录，而 TBX3?NPF 和 TBX3?RRM 对转录的促进作用明显减弱。这些实验表明，NPF 和 RRM 基序在 WREs 结合中，主要介导 TBX3 与 Wnt/β-catenin 转录复合物的蛋白 - 蛋白相互作用，而非与 DNA 的结合。
研究总结与展望
揭示转录复合物的分子组成对理解细胞在发育、稳态和疾病中的行为至关重要。本研究发现 TBX3 在 CRC 和 HCC 细胞中表达，与 Wnt/β-catenin 转录复合物相互作用，调控与转移相关的基因表达，确立了 TBX3 作为 CRC 转移调节因子和潜在治疗靶点的地位。
目前，针对 Wnt 通路的抑制剂在 CRC 治疗中仍未取得突破，TBX3 的突出作用为 CRC 治疗提供了新方向。虽然 TBX3 在肠道干细胞稳态中的作用尚待明确，但鉴于其与 BCL9/9L 在小鼠中的相似表型，推测其在稳态中可能并非必需，而对癌细胞存活可能至关重要，这为靶向治疗提供了潜在的治疗窗口。
NPF 基序因其在蛋白表面的可及性和功能重要性，有望成为抗体或小分子的有吸引力的靶点。此外，其他研究已检测到 TBX3 与 β-catenin 在结肠癌细胞系中的相互作用，进一步验证了本研究的结果。未来研究可通过体内功能或基因敲除实验，明确 TBX3 在肠道干细胞稳态和癌细胞存活中的具体作用，为开发基于 TBX3 的 CRC 治疗策略奠定基础。
