OGG1S326C变异体：炎症性疾病易感性的关键分子机制与潜在治疗靶点

本文聚焦 8 - 氧代鸟嘌呤 DNA 糖基化酶 1（OGG1）的 S326C 变异体（OGG1S326C）。研究发现，该变异体在人群中广泛存在，虽修复活性降低，但能延长与 DNA 底物结合，增强炎症反应，与多种疾病相关，为炎症性疾病治疗提供新方向。

　　

研究背景

活性氧（ROS）可引发 DNA 氧化损伤，8 - 氧代鸟嘌呤（8 - oxoGua）是常见的氧化损伤产物，由 8 - 氧代鸟嘌呤 DNA 糖基化酶 1（OGG1）通过碱基切除修复（BER）途径进行修复，以维持基因组的稳定性。若 8 - oxoGua 未被修复，可能导致基因突变，与多种衰老相关疾病，如癌症和神经退行性疾病等密切相关。

人类 OGG1 基因（hOGG1）存在多种单核苷酸多态性（SNPs），其中 hOGG1^S326C变异体在人群中频率较高，在白种人群中约为 20%，在亚洲人群中高达 40 - 60%。流行病学研究表明，hOGG1^S326C是多种炎症性、代谢性疾病以及癌症的风险因素，然而其致病机制尚不明确。此前研究发现，hOGG1^S326C的酶活性受损，但携带该变异体的个体细胞中 8 - oxoGua 并未积累，且该变异体与基因组不稳定性也无关联，这使得其与疾病易感性之间的直接病因证据缺失。

近期研究揭示了 OGG1 参与促炎细胞因子 / 趋化因子转录激活的新机制。氧化应激会在炎症基因启动子区域产生 8 - oxoGua，并使 OGG1 短暂失活。此时，OGG1 可作为支架，招募转录因子，促进 ROS 应答炎症基因的及时表达。基于此，本研究推测 hOGG1^S326C变异体导致个体疾病易感性增加，可能源于其受损的损伤切除活性，进而加剧炎症驱动的病理过程。

实验方法

1. 构建小鼠模型：利用 CRISPR - Cas9 基因编辑技术构建了 Ogg1^S326/S326和 Ogg1^S326C/S326C基因型小鼠，用于研究 hOGG1^S326C变异体对炎症基因表达和肺部炎症的影响。
2. 细胞实验：使用小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），包括 Ogg1^+/+和 Ogg1^?/?细胞，以及在 Ogg1^?/? MEF 细胞中异位表达野生型 hOGG1（YFP - OGG1）及其变异体（YFP - OGG1^S326C、YFP - OGG1^F319A），通过多种实验技术，如逆转录定量聚合酶链反应（RT - qPCR）、荧光原位杂交（FISH）等，研究炎症基因的表达变化。
3. 体内外实验技术：采用多种实验技术，如片段长度分析使用修复酶（FLARE）彗星试验、染色质免疫沉淀（ChIP）试验、免疫沉淀（IP）试验、蛋白质印迹（western - blotting）、电泳迁移率变动分析（EMSA）、体外激酶试验、液相色谱 - 质谱 / 质谱（LC - MS/MS）分析等，从分子、细胞和组织水平探究 OGG1^S326C变异体的作用机制。
4. 药物干预实验：使用 OGG1 活性位点抑制剂 TH5487，通过腹腔注射或其他合适方式给药，观察其对 OGG1 与 DNA 底物结合、炎症基因表达和肺部炎症的影响。

实验结果

1. OGG1^S326C变异体诱导促炎细胞因子 / 趋化因子的持续表达
   • 小鼠实验：建立急性肺损伤小鼠模型，通过鼻内注射脂多糖（LPS）诱导促炎基因表达。结果显示，Ogg1^S326C/S326C小鼠肺部促炎细胞因子和趋化因子（如 Cxcl2、Cxcl1、Ccl2、Ccl20、Il6、Tnf - α）的 mRNA 水平显著高于 Ogg1^S326/S326小鼠。经 LPS 刺激 16 小时后，Ogg1^S326C/S326C小鼠肺部炎症细胞浸润增加，支气管肺泡灌洗液（BALF）中中性粒细胞数量显著增多。给予 OGG1 抑制剂 TH5487 后，可有效抑制促炎基因表达，降低炎症细胞浸润。
   • 细胞实验：在 MEF 细胞实验中，Ogg1^?/?细胞经 TNFα 刺激后，炎症基因表达显著低于 Ogg1^+/+细胞。在 Ogg1^?/? MEF 细胞中异位表达 OGG1^S326C，经 TNFα 刺激后，相关炎症基因的表达不仅在早期高于表达野生型 OGG1 的细胞，且在 2 小时时仍维持较高水平，表明 OGG1^S326C变异体促进了基因转录的持续上调。
   
   
2. OGG1^S326C与 DNA 底物的结合增加，酶活性降低
   • 体内实验：通过 FLARE 彗星试验检测小鼠肺部细胞中 8 - oxoGua 的积累情况，结果显示，LPS 刺激后，Ogg1^S326C/S326C基因型小鼠细胞的橄榄尾矩（OTM）值显著高于 Ogg1^S326/S326基因型小鼠，表明 OGG1^S326C变异体在炎症条件下从基因组中及时切除 8 - oxoGua 的能力低于野生型 OGG1。
   • 体外实验：利用含有 8 - oxoGua 的 DNA 双链探针进行切割试验和 EMSA 实验，发现 GST - OGG1^S326C切除 8 - oxoGua 的活性低于野生型 OGG1，但其与 8 - oxoGua 的结合能力显著增强，解离常数（K_d）降低，表明其 DNA 结合亲和力增加约 50%。此外，OGG1 抑制剂 TH5487 可有效抑制 OGG1^S326C与 DNA 的结合和底物切割。
   • 二聚化实验：通过邻近连接测定（PLA）和荧光共振能量转移（FRET）分析发现，TNFα 刺激可增加 OGG1^S326C在非可溶性染色质部分的二聚化水平，且这种二聚化依赖于 ROS，N - 乙酰半胱氨酸（NAC）预处理可抑制其发生。
   
   
3. OGG1^S326C维持 NF - κB 在基因启动子上的 DNA 占位
   • ChIP 实验：在 HEK293 细胞中过表达 Flag - 标记的野生型 OGG1、Flag - OGG1^S326C和 Flag - OGG1^F319A，进行 ChIP 实验。结果显示，TNFα 刺激 60 分钟后，OGG1^S326C与促炎基因（如 CXCL2、CXCL1、IL6、TNF - α）启动子区域的结合显著增加，且在 120 分钟时仍维持较高水平。同时，OGG1^S326C表达细胞中 NF - κB 与炎症基因启动子的结合明显高于野生型 OGG1 或 OGG1^F319A表达细胞。
   • PLA 实验：PLA 实验结果表明，TNFα 刺激 60 分钟后，OGG1^S326C与染色质相关的 RelA/p65 相互作用的能力显著高于野生型 OGG1，NAC 或 TH5487 处理可抑制这种相互作用。
   
   
4. CDK4 介导的 hOGG1 在 S326 位点的磷酸化在炎症刺激下下降
   • IP 实验：在 HEK293 细胞中，免疫沉淀实验显示，正常条件下 OGG1 的磷酸化水平较高，TNFα 刺激后迅速下降，60 分钟时达到最低水平，120 - 180 分钟逐渐恢复。NAC 处理可减弱 OGG1 的去磷酸化，表明 ROS 参与了 OGG1 的去磷酸化过程。
   • 激酶鉴定实验：通过蛋白质质谱分析、共免疫沉淀和 PLA 实验，确定 CDK4 是负责 OGG1 磷酸化的激酶。在 TNFα 刺激下，OGG1 与 CDK4 的相互作用先降低后恢复，且与 OGG1 和 RelA/p65 的相互作用动力学相反。
   • 位点验证实验：通过多种实验方法，如 GPS 5.0 预测、LC - MS/MS 分析、定制抗体检测和体外激酶试验等，证实 S326 是 OGG1 的主要磷酸化位点，且 CDK4 介导的 S326 磷酸化和炎症触发的去磷酸化构成一个调节循环。
   
   
5. S326 位点的去磷酸化促进 OGG1 与 DNA 底物的结合并促进基因表达
   • 体外实验：利用重组蛋白进行切割试验和 EMSA 实验，发现 OGG1^S326E（模拟 OGG1 在 S326 位点磷酸化）的切割活性与野生型 OGG1 相当，但与 DNA 底物的结合能力明显降低。
   • 细胞实验：在 Ogg1^?/? MEF 细胞中转染野生型 OGG1 和 OGG1^S326E表达质粒，经 TNFα 刺激后，RT - qPCR 分析显示，表达 OGG1^S326E的细胞中促炎基因（如 Tnf - α、Cxcl1、Il6、Cxcl2）的表达低于表达野生型 OGG1 的细胞。ChIP 实验和 PLA 实验结果表明，OGG1^S326E与促炎基因启动子区域的结合减少，与 NF - κB 的相互作用也减弱。
   • 体内实验：构建表达 GFP 标记的小鼠 Ogg1 及其突变体（GFP - Ogg1S326 (H) 和 GFP - Ogg1S326C (H)）的质粒，转染细胞和小鼠实验表明，S326 位点的去磷酸化增强了 OGG1 在基因转录激活中的功能，而 OGG1^S326C变异体由于缺乏该磷酸化位点，不仅避免了磷酸化带来的损伤，还增强了其在转录激活中的功能。
   
   

讨论

传统观点认为 OGG1 是一种 DNA 修复酶，负责启动 BER 途径以维持基因组保真度。而本研究发现，与野生型 OGG1 相比，OGG1^S326C变异体尽管酶活性受损，但与 DNA 底物的结合时间延长。在炎症刺激下，OGG1^S326C可诱导促炎细胞因子和趋化因子基因的表达升高且持续时间更长。

此前关于 OGG1^S326C的功能存在争议，不同研究结果不一致。本研究表明，在生理条件下，OGG1^S326C可能与野生型 OGG1 一样修复 8 - oxoGua，只是过程相对延迟。但在炎症条件下，ROS 水平升高，OGG1^S326C的修复活性下降，可能是由于二聚化和 / 或缺乏 APE1 介导的对其底物周转的增强作用。不过，此时应更关注其与 8 - oxoGua 的长时间结合，这在转录调控中具有重要意义。

研究还发现，OGG1 在 S326 位点的磷酸化对其功能至关重要。在生理条件下，CDK4 介导的 S326 磷酸化使 OGG1 处于高磷酸化状态，降低了其与 DNA 底物的亲和力，有利于其在基因组中高效搜索 DNA 损伤位点。而在炎症刺激下，S326 位点去磷酸化，使 OGG1 与启动子嵌入的底物结合更紧密，便于招募转录因子，促进促炎细胞因子和趋化因子的转录激活。相比之下，OGG1^S326C本身对底物具有更高的亲和力，在氧化应激条件下，其上调基因转录的能力可能优于去磷酸化的野生型 OGG1。

此外，OGG1^S326C变异体与癌症易感性密切相关。由于炎症与癌症关系紧密，OGG1^S326C促进炎症反应的特性可能进一步增加了携带该变异体个体患癌症的风险。同时，研究还发现 Ogg1^?/?小鼠在某些疾病模型中的表现与 Ogg1^+/+小鼠不同，推测 OGG1^S326C在炎症性肠病（IBD）和肥胖等疾病中可能具有保护作用，但具体机制尚待进一步研究。

综上所述，本研究揭示了 OGG1^S326C与炎症性疾病易感性之间的病因联系，为理解相关疾病的发病机制提供了新的视角。基于这些发现，使用小分子抑制剂（如 TH5487）阻断 OGG1 和 OGG1^S326C的底物结合位点，在预防或减轻急性 / 慢性炎症反应方面具有潜在的临床应用价值，有望为相关疾病的治疗开辟新的途径。