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这篇研究利用 MSK - ACCESS 检测视网膜母细胞瘤患者的 RB1 嵌合体，发现 14.7% 患者存在 RB1 嵌合体，其在治疗后会持续存在，还影响疾病双侧性。检测 RB1 嵌合体对避免 cfDNA 检测假阳性、优化诊疗意义重大。
研究背景
游离 DNA（cfDNA）是细胞释放到细胞外的 DNA，肿瘤患者体内肿瘤细胞凋亡、坏死会释放肿瘤 DNA 到循环系统，使 cfDNA 成为肿瘤变异分析的重要材料。血沉棕黄层富含白细胞等，能提供用于基因分析的高质量基因组 DNA。
MSK - ACCESS 是一种下一代测序（NGS）检测方法，结合血浆 cfDNA 和血沉棕黄层基因组 DNA 测序，可检测多种变异，包括体细胞、生殖系和嵌合变异，且能排除克隆性造血干扰，凭借高深度覆盖有机会检测到低变异等位基因分数（VAF）的嵌合变异。
视网膜母细胞瘤是常见的儿童原发性眼癌，约 98% 由 RB1 功能缺失变异引发，这些变异有体细胞、生殖系杂合或嵌合等形式。已有研究表明，可在视网膜母细胞瘤患者血浆 cfDNA 中检测到肿瘤来源的 RB1 变异，且变异等位基因分数变化能反映治疗反应和疾病状态，但 RB1 嵌合体对血浆 cfDNA 检测的影响尚不明确。
研究方法
本研究经纪念斯隆凯特琳癌症中心机构审查委员会批准，参与者均签署了体细胞和生殖系基因分析的知情同意书，且未获研究报酬，遵循流行病学观察性研究报告加强声明（STROBE）准则。数据分析在 2024 年 4 月 - 9 月进行。
2020 年 7 月 - 2024 年 4 月，参与者接受 MSK - ACCESS 检测，对 cfDNA 和血沉棕黄层来源的基因组 DNA 进行分析，有条件者在治疗前后多次检测。MSK - ACCESS 先进行杂交捕获，再进行双端测序，可检测多种基因组异常，探针覆盖 129 个基因，包括 RB1 基因全部外显子，还用单核苷酸多态性（SNP）指纹确认 cfDNA 和白细胞 DNA 匹配。同时，用 MSK - IMPACT 检测确认 RB1 嵌合变异，两者均获纽约州卫生部临床使用批准，血沉棕黄层 DNA 检测到的生殖系变异按美国医学遗传学与基因组学学会指南分类。
此外，通过特定方法推断参与者遗传血统，利用 1000 基因组计划的 3000 多个常染色体 SNP 和 ADMIXTURE 模型计算非洲、东亚、欧洲、美洲原住民和南亚人群血统比例，并用额外 SNP 标记推断阿什肯纳齐犹太血统。统计分析采用 2 样本 t 检验比较嵌合和杂合参与者，用二项式检验计算百分比置信区间，使用 R 4.3.2 软件。
研究结果
参与者特征
136 例视网膜母细胞瘤患者接受 MSK - ACCESS 检测，女性占 54.4%，诊断时中位年龄 1.0 岁，最年轻患者不到 1 个月。参与者种族多样，超半数（52.9%）来自非欧洲遗传血统。
RB1 变异检测
在血沉棕黄层来源 DNA 中，80 例（58.8%）检测到致病性 RB1 变异，VAF 在 1.2% - 64.3%。分析其他基因杂合变异确定 RB1 变异分类标准：血沉棕黄层 DNA 中，VAF 低于 35.0% 的单核苷酸变异（SNV）和低于 25.0% 的插入或缺失（indel）归为嵌合变异；25.0% - 35.0% 的 indel 为疑似嵌合变异；更高 VAF 为杂合变异。最终确定 60 例杂合变异，20 例嵌合变异（含 5 例疑似嵌合 indel）。12 例嵌合变异患者多次检测，VAF 稳定。
11 例嵌合变异患者经 MSK - IMPACT 检测，结果与 MSK - ACCESS 一致，仅 1 例 VAF 有差异。15 例曾在外部实验室检测的嵌合变异患者中，11 例检测出相同变异，但仅 4 例正确报告为嵌合变异，7 例分类错误或未提供合子信息，4 例外部实验室检测阴性而 MSK - ACCESS 检测阳性。
110 例患者 cfDNA 检测到致癌性 RB1 变异，包含所有血沉棕黄层检测到的杂合和嵌合变异。26 例 cfDNA 阴性可能因体细胞疾病缓解后采样，少数情况可能是 MYCN 扩增且 RB1 野生型（MYCNARB1+/+）的视网膜母细胞瘤。
治疗后，体细胞疾病患者 cfDNA 的 RB1 VAF 大幅下降至检测不到，直至疾病复发；生殖系杂合患者 cfDNA VAF 稳定在 47.8% 左右；RB1 嵌合患者 cfDNA VAF 先下降，后稳定在接近嵌合变异水平，即便无疾病活动。
RB1 嵌合体与疾病双侧性
136 例患者中 49.3%（67 例）为双侧疾病。杂合 RB1 变异患者双侧疾病风险最高（91.7%），血沉棕黄层未检测到 RB1 变异患者风险最低（1.8%），RB1 嵌合患者双侧疾病风险低于杂合患者（55.0% vs 91.7%）。双侧疾病的 RB1 嵌合患者 VAF 高于单侧患者，提示 VAF 与疾病双侧性可能相关。
杂合 RB1 变异患者诊断年龄小于体细胞疾病和 RB1 嵌合患者。双侧疾病患者中，杂合 RB1 变异占 82.1%，RB1 嵌合占 16.4%；单侧疾病患者中，RB1 嵌合占 13.0%，杂合占 7.2%，单侧和双侧疾病患者 RB1 嵌合患病率无差异。
讨论
遗传嵌合体在视网膜母细胞瘤等单基因遗传病中常见，但多数基因检测方法难以准确检测和量化嵌合变异，因其多针对 VAF 约 50% 的生殖系杂合变异。MSK - ACCESS 检测 136 例患者，发现 20 例 RB1 嵌合变异。
相比传统方法，MSK - ACCESS 优势明显。其采用高深度 NGS 和双端测序，能检测 VAF 低至 1% 的嵌合 SNV 和小 indel，传统方法常误判或漏检嵌合变异。MSK - ACCESS 微创，便于重复检测，利于实时监测疾病，但解读 RB1 嵌合患者 cfDNA 检测结果需谨慎，避免将嵌合变异误判为残留疾病，调整终点 VAF 可减少假阳性和过度治疗。
准确检测和量化 RB1 嵌合变异对预后和患者管理意义重大。RB1 嵌合患者双侧疾病风险低于生殖系杂合患者，且风险与嵌合水平相关，有助于临床医生根据 VAF 提供个性化诊疗。单侧和双侧疾病患者 RB1 嵌合变异频率相似，均需进行筛查。
研究也存在局限性。区分杂合和嵌合变异有难度，尤其是 VAF 临界的 indel，NGS 技术可能导致 VAF 偏差，部分疑似嵌合的高水平 indel 可能实际为杂合。嵌合现象遗传机制复杂，基于外周血的检测无法发现特定组织特异性嵌合。此外，研究未明确检测 RB1 嵌合变异对患者发病率和死亡率的影响。
结论
本研究表明 MSK - ACCESS 可检测 VAF 低至 1% 的 RB1 嵌合变异，cfDNA VAF 有望作为监测疾病和治疗反应的生物标志物。准确检测和量化 RB1 嵌合变异有助于优化咨询、治疗规划和监测，对于 cfDNA 检测持续存在 RB1 变异但无临床疾病证据的视网膜母细胞瘤患者，考虑检测 RB1 嵌合变异可降低假阳性解读和过度治疗风险。
