揭秘消泡剂：提升 Sf9 细胞培养与杆状病毒感染效率的关键钥匙

在杆状病毒表达系统用于重组蛋白生产时，泡沫形成阻碍其规模化。研究人员探究了 AF204、PPG 和 SAG471 三种消泡剂对 Sf9 细胞生长、杆状病毒感染的影响。结果显示不同消泡剂在不同浓度下效果各异，SAG471 最具潜力，为优化病毒表达系统提供参考。

　　在生物技术蓬勃发展的当下，重组蛋白生产成为生命科学领域的关键环节。杆状病毒表达系统凭借自身优势，在生产复杂且经过翻译后修饰的蛋白质方面，发挥着不可替代的作用，这些蛋白质是疫苗研发、药物生产以及结构生物学研究的核心要素。然而，随着生产规模的扩大，一个棘手的问题逐渐凸显 —— 泡沫的形成。

泡沫的出现，就像生产过程中的 “捣乱分子”，给细胞培养带来了诸多麻烦。它不仅干扰细胞的正常代谢，降低细胞的活力，影响蛋白质的结构，还可能破坏培养环境的无菌状态，让生产过程的控制变得困难重重，最终导致整体生产效率大幅下降。在其他蛋白质表达平台中，消泡剂的应用研究相对较多，可在昆虫细胞培养领域，这方面的探索却十分有限。尽管昆虫细胞培养时常用含有 Pluronic F - 68 的培养基来减少剪切应力和泡沫形成，但在工业生产的高细胞密度发酵过程中，额外的通气和搅拌操作使得泡沫问题依旧严峻。为了突破这一生产瓶颈，深入了解消泡剂对昆虫细胞培养的影响迫在眉睫。

来自德国耶拿应用科学大学（Ernst - Abbe - Hochschule, University of Applied Sciences）的研究人员 Kristina Worch、Merlin Krause 和 Antje Burse 勇挑重担，针对这一难题展开了深入研究。他们将目光聚焦在三种常用于发酵过程，但此前未在昆虫细胞培养中测试过的消泡剂上，分别是 Antifoam 204（AF204，一种不含有机硅的分散液）、聚丙二醇（PPG）和一种有机硅消泡化合物（SAG471，有机硅乳液），探究它们对草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）Sf9 细胞的生长、活力以及重组苜蓿银纹夜蛾多粒包埋核型多角体病毒（Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV）感染的影响，试图找到优化生产过程的 “密码” 。该研究成果发表在《Journal of Biological Engineering》上。

研究人员主要采用了以下几种关键技术方法：首先是细胞培养技术，将 Sf9 细胞在 Insect - XPRESS?培养基中悬浮培养，严格控制培养条件，包括温度、转速等；其次运用了多种检测实验，如通过 MTT 还原试验评估消泡剂的毒性范围，利用细胞生长实验监测细胞数量和活力变化，借助病毒滴定实验测定病毒滴度，通过感染实验观察感染动态，还有泡沫实验测试消泡剂的消泡能力；最后利用 R 软件进行数据分析，计算出 50% 抑制浓度（IC₅₀）等关键指标。

下面来看具体的研究结果：

• 消泡剂对贴壁细胞培养代谢的影响：研究人员将不同浓度的消泡剂与贴壁培养的 Sf9 细胞共同孵育 24 小时后，发现细胞形态出现了浓度和试剂特异性的变化。随着消泡剂浓度升高，与未添加消泡剂的对照组相比，细胞细胞壁变得模糊，细胞内颗粒增多。MTT 实验数据显示，PPG 在浓度高达 0.004% 时，对细胞代谢活性的抑制作用较为温和，而 AF204 和 SAG471 在较低浓度时就严重抑制了细胞生长。经计算，AF204、PPG 和 SAG471 的 IC₅₀分别为 0.0035%、0.0129% 和 0.0043%，这表明 Sf9 细胞对 PPG 的耐受性约为 AF204 和 SAG471 的三倍。
• 消泡剂对悬浮细胞培养生长行为的影响：基于上一实验计算出的 IC₅₀值，研究人员进一步测定了不同消泡剂浓度下 Sf9 细胞在悬浮培养中的生长参数。结果发现，终浓度为 0.0001% 时，AF204 和 PPG 显著促进了细胞生长，缩短了延迟期和群体倍增时间（PDT）。然而，当浓度升高到 0.0005% 和 0.001% 时，细胞生长明显受到抑制。对于 SAG471，在 0.0001% 和 0.0005% 浓度下，细胞生长与对照组在 PDT 和比生长速率（μ）方面相当，但各浓度下延迟期均延长，活细胞数量显著降低。总体而言，所有消泡剂的高浓度都会导致活细胞数量减少和最大细胞密度降低。此外，除 SAG471 外，较高浓度下延迟期明显延长。同时，细胞活力与对照组相似，且随着消泡剂浓度增加，培养过程中细胞和细胞碎片形成的边缘效应减少或消失。
• 消泡剂对杆状病毒感染性的影响：研究人员在探究消泡剂对细胞生长影响后，进一步研究其对杆状病毒感染性的作用。他们将病毒原液与消泡剂（终浓度 0.0001%）孵育 30 分钟后进行空斑实验。结果显示，各条件下的病毒滴度与未添加消泡剂的对照组相当，这表明短期接触消泡剂不会降低病毒的感染性。
• 消泡剂添加引起的感染动力学改变：在 Sf9 细胞悬浮培养开始 24 小时后（感染前），研究人员观察到添加消泡剂的细胞尺寸有所增加，不过这种差异在感染周期中持续存在，但只有 PPG 达到了统计学显著性。在未添加消泡剂的对照组中，感染后活细胞数量先增加，36 小时后下降；而添加消泡剂的培养组中，细胞数量在感染后 60 小时内保持稳定，这表明感染更有效。此外，添加消泡剂的细胞尺寸略大，裂解时间比对照组晚约 24 小时，这可能延长了蛋白质的生产时间，有利于提高重组蛋白产量。事实上，所有测试的消泡剂存在时，单细胞荧光强度均增强，表明 mCherry 产量有增加趋势，其中 AF204 的这种效果显著，而 PPG 和 SAG471 不显著。
• 消泡剂消泡能力的差异：研究人员通过向泡沫化培养基中逐步添加消泡剂（每次增加 0.0001%）来测试其消泡效率。结果显示，SAG471 表现出最高的效率，在终浓度为 0.0001% 时就能显著减少泡沫。相比之下，AF204 需要浓度高于 0.0016%，PPG 需要高于 0.001% 才能达到明显的消泡效果，而这些浓度此前已被证明会抑制细胞生长。

综合上述研究，研究人员得出结论：消泡剂对 Sf9 细胞生长具有双重影响，其效果取决于消泡剂的成分和浓度。低浓度的消泡剂可以避免细胞代谢活性降低，甚至对 AF204 和 PPG 而言，还能增加活细胞数量。需要注意的是，本研究使用的昆虫细胞培养基中已含有 Pluronic F - 68，在缺乏这种添加剂的培养基中，消泡剂的效果可能会有所不同。此外，在大规模生物反应器中，由于额外的通气和搅拌会影响泡沫形成和细胞行为，最佳消泡剂浓度可能也会有所差异。在测试的消泡剂中，SAG471 因对细胞生长影响小且消泡性能有效，被认为是最有前景的候选者，但这一结论还需在工业规模应用中进一步验证。

同时，调整消泡剂浓度不仅可以改善细胞生长，还有望优化杆状病毒感染动力学，从而提高重组蛋白产量。以往大多数基于病毒的高等细胞表达系统使用消泡剂主要是为了控制泡沫，而本研究结果表明，消泡剂还可能通过改变细胞膜特性，提高病毒感染效率和外源物质的转染效率，拓宽了消泡剂在生物技术领域的应用范围。这一研究成果为优化基于病毒的表达系统提供了新的思路和理论依据，为重组蛋白生产的工业化发展注入了新的活力，有望推动生命科学和健康医学领域相关研究的进一步发展。