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该研究对比短日照下光周期不敏感燕麦品种 VAO-8 和敏感品种白燕 2，通过转录组分析发现，VAO-8 开花可能与叶绿素合成、光合作用、碳水化合物代谢等相关基因及转录因子有关，为培育光周期不敏感燕麦品种奠定基础。
引言
燕麦（Avena sativa L.）是重要的粗粮作物，在全球谷物生产中排名第七。开花时间是影响燕麦地理适应性和产量的关键性状，受多种环境因素调控，其中光周期影响显著。根据对光周期的响应，植物可分为长日（LD）植物、短日（SD）植物和日中性（DN）植物。燕麦是典型的长日作物，多数品种在短日照下开花受抑制。
尽管已发现一些燕麦光周期不敏感相关基因，但此前研究多局限于两个品种在生殖转换阶段的比较，对不同品种在短日照下各发育阶段光周期敏感性差异的研究较少。本研究以光周期不敏感的 VAO-8 和敏感的白燕 2 为材料，在短日照条件下观察其发育阶段，利用 RNA 测序技术分析转录组差异，旨在揭示燕麦光周期不敏感的分子机制，为培育相关品种提供理论依据。
材料和方法
实验选用加拿大农业和农业食品部的 VAO-8 和中国吉林白城农业科学院的白燕 2 作为植物材料。将两种燕麦种子播种在装有田间土壤的塑料盆中，每盆 5 粒，置于人工气候室，在短日照（10 h 光 / 14 h 暗）、8000 lx 光照强度、白天 24℃、夜间 20℃条件下培养。在短日照处理 50 d（S1）、60 d（S2）、70 d（S3）和 85 d（S4）时，采集第四片完全展开的真叶，每个时间点取 3 个生物学重复，每个重复包含 3 株植株，采集后立即液氮速冻并保存于 - 80℃用于转录组测序。
通过解剖茎尖分生组织（SAM），去除周围叶片，将其固定在甲醛 - 醋酸 - 乙醇固定液（FAA）中至少 24 h，经梯度乙醇脱水后，进行扫描电镜（SEM）观察，以确定 SAM 的发育阶段。
采集不同阶段的叶片，用丙酮和无水乙醇（体积比 2:1）混合液浸泡 24 h，在黑暗中 25℃孵育。使用紫外 - 可见分光光度计测定样品在 663 nm 和 645 nm 处的吸光度，根据 Arnon 公式计算叶绿素 a（Chl a）、叶绿素 b（Chl b）和叶绿素总量（Chls）的浓度。
采用北京 ComWin Biotech Co., Ltd. 的 Ultrapure RNA Kit 提取燕麦材料的总 RNA，用 NanoDrop 2000 分光光度计和 Agient2100/LabChip GX 分析仪检测 RNA 质量和完整性。高质量 RNA 用于构建转录组文库，由 Biomarker Technologies Co., Ltd.（北京）在 Illumina NoveSeq6000 平台上进行测序（PE = 150），原始数据上传至 NCBI，登录号为 PRJNA1019673。
去除低质量和含接头的 reads，得到干净数据，用 HISAT2 软件将其比对到 OT3098 v2 六倍体燕麦基因组。通过比对结果和每千碱基转录本每百万映射读数的片段数（FPKM）评估基因表达水平，使用 DESeq2 软件鉴定差异表达基因（DEGs），筛选条件为错误发现率（FDR）≤ 0.05 且 | log2倍数变化（FC）|≥1。利用生物信息学在线平台和 TBtools v1.132 软件绘制维恩图和热图。对 DEGs 进行基因本体（GO）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集和 MapMan 分析，其中 GO 和 KEGG 富集分析在 BMKCloud 平台进行，显著富集的 GO 和 KEGG 项校正 p 值≤ 0.05，用 R 软件的 ggplot2 包绘制气泡图，用 MapMan 功能注释软件（3.6.0 版）进一步分析和可视化 DEGs。将 DEGs 的核苷酸序列提交到在线 iTAK 1.6 软件，对转录因子（TFs）进行分类。
用 Ultrapure RNA Kit 提取样品总 RNA，用 UEIris II RT-PCR System for First-Strand cDNA Synthesis with dsDNase 反转录合成 cDNA。在 PCRmax Eco 48 机器上，使用 Bimake SYBR Green qPCR Master Mix 进行 qRT-PCR，验证 10 个候选基因的表达水平，采用 2?ΔΔCt法计算基因相对表达量，以甘油醛 - 3 - 磷酸脱氢酶（GAPDH，AK251456）为内参，每个基因设置 3 个生物学重复，引物序列见表 S1。
结果
通过对 SAM 的形态观察，短日照处理 50 d 时，VAO-8 和白燕 2 均处于营养生长阶段。60 d 时，VAO-8 的 SAM 开始向伸长阶段转变，顶穹增大，表明进入生殖状态；70 d 时进入小花分化阶段，形成小花原基（FP）；85 d 时处于孕穗期，说明 VAO-8 能在短日照下正常抽穗。而白燕 2 的 SAM 在整个处理期间一直停留在营养生长阶段，表明其对光周期极为敏感，证实 VAO-8 对光周期不敏感，能在短日照下正常开花。
对两个品种在四个阶段的第四叶样品进行 RNA-Seq，数据过滤后，每个样品产生 5.76 Gb 干净数据，所有 24 个 RNA-Seq 文库的 Q30 值均大于 95.33%，唯一比对序列百分比大于 85.43%，各时间点三个生物学重复的皮尔逊相关系数大于 0.82，表明数据质量和重复性良好。
根据筛选条件，确定四个比较组中的 DEGs 数量。V8-S1_vs_B2-S1、V8-S2_vs_B2-S2、V8-S3_vs_B2-S3 和 V8-S4_vs_B2-S4 比较组中分别有 824、1189、646 和 1145 个 DEGs，其中上调 DEGs 分别为 381、724、331 和 663 个，下调 DEGs 分别为 443、465、315 和 482 个。维恩图显示，四个比较组中有 45 个上调 DEGs 和 77 个下调 DEGs 是共享的。
对 10 个选定的 DEGs 进行 qRT-PCR 验证，包括 3 个 TFs、1 个参与淀粉和蔗糖代谢的基因、4 个与 EMP-TCA 途径相关的基因和 2 个参与叶绿素生物合成过程的基因。结果显示，qRT-PCR 测定的基因相对表达水平与 RNA-Seq 结果一致，相关系数为 0.928，验证了 RNA-Seq 数据的准确性。
对 DEGs 进行 GO 富集分析，S1 阶段，上调 DEGs 仅富集到 “防御反应” 这一生物学过程（BP），下调 DEGs 无富集 GO term，表明早期营养生长阶段两者开花差异不明显。S2 阶段，上调 DEGs 富集到 “三羧酸循环” 和 “谷氨酰胺转运”，表明 VAO-8 在开花早期能量代谢和氨基酸代谢增强；下调 DEGs 富集到 8 个 BP term，可分为生物合成和代谢过程、信号转导、刺激响应三类。S3 阶段，上调 DEGs 富集到 “叶绿素生物合成过程” 和 “叶绿体 - 细胞核信号通路”，与叶绿素相关；S4 阶段，上调 DEGs 富集到 12 个 BP term，涉及物质合成、能量代谢、光合作用和蛋白质修饰等，下调 DEGs 无富集。糖代谢相关过程在多个阶段出现，表明 VAO-8 从开花早期就开始调节糖类代谢过程。从 S2 到 S4，VAO-8 增强的过程比白燕 2 更多，从而实现开花。
进一步分析发现，从 S1 到 S4，上调 DEGs 中富集了 17 个 BP term，可分为四类。第一类包括 “叶绿素生物合成过程” 和 “肉桂酸生物合成过程” 等生物合成和代谢相关过程。VAO-8 在 S3 和 S4 时，Chl a、Chl b 和 Chls 含量均显著高于白燕 2，表明其在短日照下叶绿素含量更高。“肉桂酸生物合成过程” 中的相关基因在 VAO-8 中表达增加，说明 VAO-8 能增加次生代谢物和氨基酸生物合成过程以促进开花。
第二类是光合作用相关过程，包括 “碳固定” 和 “光系统 I 中的光捕获”。VAO-8 中参与 “碳固定” 和 “光系统 I 中的光捕获” 的基因表达上调，增强了其捕获和传递光能的能力，促进了开花。第三类与蛋白质修饰相关，第四类与刺激响应相关。此外，VAO-8 在三羧酸循环途径上与白燕 2 差异显著，增强了能量转换和传递，有利于在短日照下开花。
KEGG 通路富集分析表明，S1 阶段，VAO-8 和白燕 2 之间无差异富集通路。S2 阶段，VAO-8 上调 DEGs 在异黄酮生物合成、植物 - 病原体相互作用和淀粉与蔗糖代谢等通路富集；S3 阶段，在植物 - 病原体相互作用和光合作用 - 天线蛋白通路富集；S4 阶段，在光合作用 - 天线蛋白、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、光合生物的碳固定、植物 - 病原体相互作用和氨基酸生物合成等通路富集。其中，光合作用 - 天线蛋白通路在 S2 和 S3 共享，淀粉和蔗糖代谢通路在 S2 显著富集。这些结果表明，VAO-8 中与能量代谢和光合作用相关的通路发生了明显改变，增加的光合活性和能量代谢过程可能促进其在短日照下开花。
利用 MapMan 工具分析 DEGs 的代谢过程，发现营养生长阶段，VAO-8 和白燕 2 之间代谢过程和涉及的 DEGs 变化不大；后期阶段，特别是 S4，更多代谢过程和 DEGs 被激活和增加。S2、S3 和 S4 三个发育阶段，VAO-8 中参与光合作用、细胞壁合成、糖酵解、柠檬酸循环（TCA 循环）和次生代谢过程的 DEGs 主要上调，一些与脂质、氨基酸和核苷酸代谢相关的 DEGs 也受短日照影响。
进一步分析糖酵解过程相关 DEGs，发现 VAO-8 在 S2、S3 和 S4 时，与白燕 2 相比，多个参与糖酵解的基因表达发生显著变化，且上调基因更多，表明 VAO-8 在短日照下 EMP 途径代谢更活跃，为开花诱导提供能量支持。此外，参与次生代谢中类异戊二烯合成途径的部分基因在 VAO-8 中上调，说明这些代谢过程可能在 VAO-8 开花调控中起重要作用。
基于转录组数据，在 S2、S3 和 S4 阶段分别鉴定出 37、26 和 52 个差异表达的 TFs。除 8 个 TFs 在不同阶段表达趋势和倍数变化相似外，其余 93 个 TFs 分为 30 个家族，其中 GARP、NAC、WRKY 等家族占主导。多数 WRKY TFs（9 个中有 8 个）和 NAC TFs（9 个中有 5 个）在 VAO-8 中上调，多数 bHLH TFs（7 个中有 5 个）下调，表明 VAO-8 在短日照下的开花调控受多个开花途径和 TFs 的正负调控。
讨论
开花是影响植物产量和品质的重要农艺性状，受遗传和环境因素精确调控。光周期是影响植物开花和生长习性的关键环境信号之一，降低作物对光周期的敏感性对全球作物种植和产量保障至关重要。目前已发现多种开花信号通路，多个关键开花基因在开花调控中起重要作用。
本研究中，VAO-8 对光周期不敏感，白燕 2 敏感。基于研究结果提出了短日照下两者开花调控网络模型，认为从营养生长到生殖生长的转变受多个信号通路调节。短日照下，VAO-8 中参与甲基赤藓糖醇 4 - 磷酸（MEP）途径和四吡咯生物合成途径（TBP）的基因上调，使其叶绿素含量增加。叶绿素含量与光合效率密切相关，VAO-8 中叶绿素含量的差异导致光合作用改变，进而增加碳水化合物和能量代谢过程，促进开花。同时，鉴定出的多个差异表达 TFs 可能通过多个开花途径共同作用，使 VAO-8 在短日照下进入生殖阶段。
光周期途径不仅通过与内外开花途径相互作用影响开花，还与代谢途径相互关联。近年来研究表明，光合作用相关的次生代谢物信号，如叶绿素，在长日或短日条件下影响植物开花时间。植物中叶绿素生物合成有 MEP 和 TBP 两条途径，MapMan 分析显示，VAO-8 中 MEP 途径的 DXS 基因和 TBP 途径的多个基因上调，使其能积累更多叶绿素，在 S3 和 S4 时，Chl a、Chl b 含量同步上调，暗示叶绿素可能作为开花信号触发营养生长向生殖生长的转变。叶绿素水平还可能影响糖生物合成过程，但两者之间的相互作用仍需进一步研究。
叶绿素与光合作用呈正相关，增加的叶绿素可吸收更多光能产生更多碳源，光合作用与植物开花时间相关。本研究中，KEGG 通路 “光合作用 - 天线蛋白” 在 VAO-8 上调 DEGs 中显著富集，其中 7 个光系统 II 叶绿素 a/b 结合蛋白基因上调。光系统 II（PSII）中的光捕获复合体 II（LHC II）参与光合作用并调节植物生长发育，沉默相关基因会影响光合作用和植物生长。VAO-8 中这些基因的上调可能促进了电子传递，提高了光合活性，这可能与 VAO-8 在短日照下开花有关，但仍需进一步验证。
在光合植物中，碳水化合物调节植物发育和开花时间。GO 和 KEGG 富集分析表明，VAO-8 中 “三羧酸循环”“碳固定” 和 “淀粉和蔗糖代谢” 等途径相关 DEGs 上调，说明其通过碳水化合物代谢提供更多能量，促进开花。参与糖降解过程的部分基因在 VAO-8 中也上调，可能产生更多可溶性糖，参与多种生理过程。糖不仅是能量来源，也是影响开花时间的信号分子。海藻糖 - 6 - 磷酸（T6P）在调节开花时间中起重要作用，本研究中，VAO-8 中一个 TPS 基因和一个 TPP 基因显著表达，表明蔗糖代谢介导的 T6P/TPS 基因在其开花调控中起重要作用。
转录因子参与植物生长发育的多个过程，包括开花调控。本研究鉴定出多个差异表达 TFs，主要富集在 WRKY、GARP 等家族。WRKY 家族在 VAO-8 响应短日照和开花时间调控中起重要作用。GARP 家族的 type-B ARRs 和 bZIP 家族的 ABI5 等 TFs 也参与开花调控，此外，多个家族的 TFs 通过激素途径基因和光周期诱导开花途径影响开花时间。但这些 TF 家族基因与 VAO-8 在短日照下开花的具体关系仍需进一步功能验证。
结论
本研究通过表型鉴定和转录组分析，对比了短日照下光周期不敏感的 VAO-8 和敏感的白燕 2 在四个发育阶段的差异。结果表明，VAO-8 能在短日照下正常抽穗，具有光周期不敏感性。转录组分析显示，VAO-8 在短日照下开花可能与叶绿素合成、光合作用、碳水化合物代谢、次生代谢过程相关基因及转录因子的上调表达有关。这些候选基因将在未来研究中进行功能验证，为深入理解燕麦光周期不敏感的分子机制提供依据，也为培育光周期不敏感的燕麦品种奠定基础。
