重组蛋白谱库(rPSL)结合DIA-MS技术显著提升低丰度癌症相关蛋白及犬尿氨酸通路蛋白的鉴定与定量

本研究针对数据非依赖采集质谱(DIA-MS)技术中低丰度蛋白检测灵敏度不足的瓶颈，创新性地构建了包含42种人类重组蛋白的参考谱库(rPSL)，并结合样本特异性生物谱库形成混合谱库(biological-rPSL)。通过对比传统DDA谱库和无库分析方法，研究证实rPSL策略可显著提高乳腺癌和结直肠癌组织中IDO1、TDO2等犬尿氨酸(KYN)通路关键酶及癌症相关蛋白的检出率，为肿瘤微环境研究和精准医疗提供了新工具。

　　

在肿瘤生物学研究领域，低丰度蛋白的精准检测始终是技术攻坚的难点。这类蛋白虽然含量微小，却往往在癌症发生发展和免疫逃逸过程中扮演关键角色，例如犬尿氨酸(KYN)通路中的限速酶吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)和色氨酸2,3-双加氧酶(TDO2)。尽管针对这些靶点的抑制剂已进入90余项临床试验，但多数因患者筛选标准不精确而折戟沉沙。究其根源，传统抗体检测方法存在交叉反应风险，而常规质谱技术又难以捕捉低丰度蛋白信号——这正是Macquarie大学团队在《Communications Chemistry》发表突破性研究的出发点。

研究人员开创性地将42种重组蛋白（涵盖KYN通路酶、细胞因子和癌症标志物）构建为标准谱库(rPSL)，并与组织样本的DDA谱库整合形成混合谱库(biological-rPSL)。通过对比分析12对乳腺癌/结直肠癌组织与5种癌细胞系在四种DIA数据处理流程（生物谱库、rPSL、混合谱库和无库分析）下的表现，研究采用Orbitrap Exploris 480质谱仪进行DIA/DDA数据采集，并运用DIA-NN和Fragpipe平台进行严格的数据处理（Q值<0.01，肽段长度≥9AA）。

Enhanced identification of lower-abundance proteins
在组织实验中，rPSL成功检出19种被传统DDA谱库遗漏的蛋白，如CXCL8和IDO2。混合谱库使肽段鉴定总数增加551条，其中ITGAV的覆盖度从33.78%提升至62.6%。细胞实验同样显示，rPSL新增检出23种蛋白，包括临床关注的TDO2和KMO。

Evaluation of protein and peptide detection
对比分析显示，rPSL-DIA在肿瘤组织中定量到39种目标蛋白，较传统方法多出14种。特别值得注意的是，混合谱库在非癌组织中检出S100A8的比例达100%（传统方法仅58%），且IDO1在TNBC亚型的过表达模式与既往IHC结果高度一致。

Assessing the sensitivity and consistency
在IFN-γ处理的癌细胞实验中，混合谱库成功捕捉到MDA-MB-231细胞中IDO1的显著诱导（p=0.0006）和TDO2的抑制（p=0.0034），揭示了缺氧应激反应。结直肠癌HT-29细胞中KLK3的异常高表达（p<0.0001）则为新发现的潜在治疗靶点。

这项研究通过创新性的谱库构建策略，实现了三个维度的突破：技术层面，rPSL将低丰度蛋白检测限推进至传统方法的1/10；临床层面，首次在单次实验中同步定量KYN通路多个限速酶；转化医学层面，为IDO1抑制剂临床试验的精准患者分层提供了可靠工具。正如作者强调的，该方法特别适用于珍贵临床样本（如穿刺活检）的多组学研究，其模块化设计也支持根据研究需求定制靶标组合。未来结合离子淌度分离(diaPASEF)技术，有望进一步解锁肿瘤微环境中更隐秘的调控网络。