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本文聚焦重组腺相关病毒（rAAV）血清型 8。研究发现，VP1 N 端热解折叠影响 rAAV8 基因组释放，该成果为 rAAV 在基因治疗中的应用提供关键理论依据，有助于优化载体设计，提升治疗效果，值得关注。
研究背景
腺相关病毒（AAV）是一种无包膜病毒，能将单链 DNA（ssDNA）包裹在二十面体衣壳中，属于细小病毒科依赖病毒属。重组腺相关病毒（rAAV）作为基因治疗的载体，其衣壳由 VP1、VP2 和 VP3 三种主要病毒蛋白组成。此前关于 rAAV 基因组释放的研究结果存在矛盾，可能与样本纯度、VP 化学计量比以及分析方法的局限性有关。本研究聚焦 rAAV 血清型 8（rAAV8）的 VP 化学计量比，利用多种生物物理方法探究热诱导的基因组释放和衣壳热稳定性。
实验材料与方法
- rAAV8 制备：rAAV8 载体可购买或自制，自制时通过将 Rep2 和 Cap8 等质粒以 1:1:1 的比例共转染到悬浮的 HEK293F 细胞中，96 小时后收获并经亲和层析和氯化铯密度梯度超速离心（CsCl DG - UC）纯化。
- 多种检测方法：运用毛细管凝胶电泳结合十二烷基硫酸钠及紫外检测（CE - SDS）、毛细管凝胶电泳结合激光诱导荧光检测（CE - LIF）、基于轨道阱的电荷检测质谱（CD - MS）、质量光度法（MP）、纳米差示扫描荧光法（nano - DSF）、氢 / 氘交换质谱（HDX - MS）、沉降速度分析超速离心（SV - AUC）等技术对样本进行检测分析。
实验结果
- 不同 rAAV8 粒子的表征：制备出三种 VP 化学计量比不同的 rAAV8 样本，分别为 VP1/VP2 与 VP3 比例高、VP1/VP2 与 VP3 比例低以及仅含 VP3 的粒子。CE - SDS 确定了不同样本的 VP 化学计量比，CE - LIF 和 CD - MS 表明所有粒子包裹的 ssDNA 基因组长度相同，且成功去除了空粒子（EPs）。
- 热诱导基因组释放：不同 VP 化学计量比的 rAAV8 样本在不同温度孵育后，MP 分析显示随着温度升高，EPs 比例增加，FPs 比例下降。70°C 孵育后未检测到粒子，可能是由于释放的基因组介导形成了大聚集体。nano - DSF 结果表明，VP1 N 端热解折叠的起始温度（Tonset1）约为 55°C，熔解温度（Tm1）约为 60°C，而 VP3 变性和衣壳解体的起始温度（Tonset2）高于 70°C，说明在 70°C 以下基因组释放和衣壳解体基本不重叠。
- 热诱导结构变化：MP 观察到加热时含 VP1 和 VP2 的粒子与玻璃表面结合特性改变，nano - DSF 检测到含 VP1/VP2 粒子的小转变，对应 VP1 N 端的解折叠。HDX - MS 显示加热时 VP1u 区域氘摄取增加，5 - 折叠轴区域结构动力学增强。
- 加热时 rAAV8 溶液中的粒子分布：SV - AUC 分析发现，rAAV8 加热后形成大聚集体，50°C 孵育时粒子分布变化不明显，60°C 孵育产生新的峰，分别对应不同状态的粒子，如完整粒子（FPs）、空粒子（EPs）等。
- 完整和过包装 rAAV8 的热诱导基因组释放：商业 rAAV8 样本经 CsCl DG - UC 分离后，MP 和 CE - LIF 分析表明，过包装粒子（OPs）在 45 - 50°C 释放基因组，加热优先释放短的 ssDNA 片段，且粒子存在三种状态：未释放 ssDNA 的衣壳、完全释放基因组并观察为空粒子的衣壳、完全释放基因组并将其拴在表面的衣壳。
讨论
- 研究结论解释差异：本研究解释了以往 rAAV 基因组释放研究结果不一致的原因，即封装基因组大小和 VP1 N 端热稳定性的差异。VP1 N 端折叠可阻止基因组进入 5 - 折叠轴的孔，解折叠则促进基因组释放，且短 ssDNA 比全长基因组更易从衣壳中排出。
- 粒子状态与结构变化：rAAV8 粒子加热时保留组装衣壳释放基因组，部分释放的基因组拴在衣壳表面，衣壳在加热后呈现不同结构形状。此外，研究还发现 rAAV8 加热时会形成大聚集体，且在不同温度下粒子浓度和状态会发生变化。
- 研究意义与展望：本研究阐明了 VP1 N 端热解折叠与 rAAV 热诱导基因组释放的关系，为 rAAV 载体开发提供新视角，结合其他相关研究，有助于更深入理解 rAAV 基因组释放机制。
