基于牛津纳米孔测序技术的灵敏样本制备流程在细胞基因治疗产品中外源病毒检测中的应用研究

这篇综述介绍了CoNS-seq（浓度-核酸酶处理-序列非依赖性单引物扩增）工作流程，通过结合超滤浓缩、核酸酶消化和SISPA扩增技术，将牛津纳米孔测序（Oxford Nanopore sequencing）检测外源病毒的灵敏度提高了3个数量级（3-log），最低检测限达0.001 vg/cell。该技术解决了细胞治疗产品中宿主核酸背景干扰的难题，检测时间从传统方法28天缩短至实时分析，为需要快速放行的自体细胞治疗（autologous cell therapy）提供了符合ICH Q5A(R2)和Ph. Eur. 2.6.41指南的新型病毒安全检测方案。

　　

引言：细胞治疗产品的病毒安全挑战
自体细胞治疗产品因无法终端灭菌且制造过程涉及多次无菌操作，存在较高病毒污染风险。传统动物体内试验（in vivo）需28天，无法满足快速放行需求。尽管监管指南（ICH Q5A(R2)）推荐高通量测序（HTS）替代传统方法，但短读长测序需先完成测序才能分析，耗时仍超过1周。牛津纳米孔测序凭借实时碱基识别和序列比对优势，可大幅缩短检测时间，但宿主核酸背景仍会掩盖低丰度病毒信号。

结果：CoNS-seq工作流程的突破性性能
检测灵敏度提升
在Jurkat T细胞模型中，CoNS-seq对猫白血病病毒（FeLV）、小鼠微小病毒（MVM）和猪圆环病毒1型（PCV1）的检测限达0.001 vg/cell，较基线方法提升1000倍。其中PCV1在0.0001 vg/cell仍可检出，总病毒检出量降低至7.5×10⁴ vg。

宿主背景消除与病毒富集
通过30kDa超滤浓缩和核酸酶处理，CoNS-seq使病毒读段相对人类基因组读段的富集倍数达20-1019倍（MVM 20倍，PCV1 1019倍，FeLV 56倍）。数字PCR（ddPCR）验证显示病毒拷贝数提升3.5-762倍。

基因组覆盖与读长优势
在0.1 vg/cell浓度下，CoNS-seq实现>90%病毒基因组覆盖，读深提升47-1544倍。长读长特性（>10kbp）可单次覆盖完整病毒基因组，显著改善未知序列的数据库匹配能力。

生物信息学验证
超几何概率模型显示，测序200万读段可确保99%概率检出0.001 vg/cell的MVM/FeLV。牛津纳米孔WIMP（What’s In My Pot）分类器与靶向分析结果高度一致，证实该方法适用于广谱病毒筛查。

讨论：技术优势与转化潜力
CoNS-seq灵敏度超越短读长测序：在5×10⁶ cells/mL高细胞密度下，仅需220万读段即可检出MVM，灵敏度较文献报道的短读长方法高10倍。其成功检测17nm的PCV1（最小哺乳动物病毒），反驳了欧洲药典对过滤步骤可能丢失病毒的担忧。

SISPA扩增虽引入区域偏好性（如PCV1复制起始区81bp富集），但长读长测序通过跨区域覆盖弥补此缺陷。对RNA病毒（如FeLV）的检测灵敏度较低，可能与反转录步骤效率相关，未来可通过优化逆转录酶改善。

应用前景
该技术不仅适用于自体细胞治疗的快速放行检测，还可替代传统体外病毒试验（IVV），解决其漏检问题（如PCV1污染轮状疫苗事件）。在微生物检测中，SISPA可同步获取耐药基因等质粒信息，优于16S rRNA测序的物种鉴定局限。

方法学创新
实验采用15mL样本经70倍超滤浓缩，核酸酶处理2小时去除游离核酸，锚定随机引物（Random_vir）进行40轮SISPA扩增。纳米孔测序使用R9.4.1芯片，minimap2比对（参数：-F 0x904过滤次级比对），覆盖度分析限定95%同源性。

监管契合性
研究涵盖WHO参考面板中三种代表性病毒（DNA/RNA/包膜病毒），为符合Ph. Eur. 2.6.41要求的验证奠定基础。通过概率模型量化检测可靠性，为GMP环境下的方法验证提供量化依据。