WPRE-RPP30杂交扩增子：病毒拷贝数检测数字化 PCR 验证的关键利器

本文介绍一种利用杂交扩增子和双链液滴数字 PCR（ddPCR）验证病毒拷贝数（VCN）检测的方法。合成WPRE-RPP30杂交扩增子作参考材料，对 ddPCR 检测进行多方面评估，证明其可有效验证数字 PCR 检测，助力细胞和基因治疗。

　　

引言

数字聚合酶链反应（PCR）技术相比传统 PCR，具有分析灵敏度高、精度好等优势。它通过将 PCR 反应分割到较小体积中，减少了标准 PCR 反应的变异性，能在扩增过程结束时提供更准确的结果，适合检测小倍数变化差异，还可对目标分子进行绝对定量。

然而，数字 PCR 在定量样本浓度时存在一些局限性。一方面，微流控技术和液滴数字 PCR（ddPCR）技术中，分区体积的准确性对检测结果影响较大。微流控技术虽理论上分区体积恒定，但 PCR 循环高温时可能因气泡产生误差；ddPCR 技术中液滴分区体积可能波动，尽管商业机器人液滴发生器可减少这种变异，但仍高度依赖每个分区的体积和一致性，且精确测量液滴体积需要高分辨率显微镜和光学轮廓仪，并非所有实验室都具备。另一方面，目前数字 PCR 仪器缺乏统一的标准验证方法，商业参考材料也不完善。

为解决这些问题，研究人员常采用商业参考材料。传统的 PCR 检测参考材料如质粒 DNA，存在需分离高质量质粒、批次间差异大以及超螺旋 DNA 会低估 DNA 浓度等缺点；合成 DNA 虽可用于定性阳性对照和评估检测的回收率，但也存在一定局限性。

本研究旨在开发一种定量方法来验证 ddPCR 反应，该方法利用参考材料评估 ddPCR 运行性能，可应用于多种场景，包括仪器鉴定、操作人员性能评估、质量控制检查以及运行间的精密度和准确性评估。研究人员合成了一种参考杂交扩增子 DNA（WPRE-RPP30），将病毒基因WPRE的扩增子与参考基因RPP30连接，用于病毒拷贝数（VCN）检测的验证。

结果

1. 单基因参考 DNA 在定量液滴数字 PCR 检测中的不可靠性：研究人员使用代表WPRE序列的双链合成 DNA 检测 ddPCR 检测的准确性，发现随着WPRE DNA 输入拷贝数增加，回收率（% recovery）降低；输入拷贝数减少，误差（% CV）增大。这表明单基因参考 DNA 不能作为 ddPCR 检测的定量阳性对照。
2. 用于参考材料的杂交扩增子WPRE-RPP30的构建：为消除潜在误差来源，研究人员构建了连接未知基因扩增子和已验证基因扩增子的参考 DNA。在当前 VCN 检测中，WPRE-RPP30杂交参考 DNA 由WPRE扩增子和RPP30扩增子通过 HindIII 限制酶切割位点连接而成。WPRE常见于逆转录病毒载体，可增强基因表达；RPP30是管家基因，在健康二倍体细胞中拷贝数稳定，可用于 VCN 检测。
3. 使用杂交扩增子WPRE-RPP30评估双链病毒拷贝数检测：研究人员使用WPRE-RPP30杂交扩增子评估双链 VCN 检测中扩增子在液滴中的分布情况。结果显示，随着输入拷贝数增加，WPRE-RPP30 DNA 会占据所有液滴，导致定量饱和。该研究确定了检测的定量上限（ULOQ）为 1.45×10⁵，定量范围为 1.45×10⁵ - 7.38，在此范围内输入和输出拷贝数呈线性相关（R² = 0.9996）。同时，研究发现 HindIII 在液滴生成和 PCR 反应前就自发切割，可用于评估目标 DNA 分布和限制酶活性。
4. 使用杂交扩增子WPRE-RPP30的回收效率：为消除 PCR 效率和准确性限制带来的误差，研究人员使用WPRE-RPP30杂交扩增子测量回收率。结果显示，WPRE和RPP30的回收率在不同 DNA 输入拷贝数下相似，约为 50% - 70%。在低输入拷贝数时，回收率可能超过 100%，这是由于测量低输入拷贝数时不准确；当输入拷贝数低于 598.08 时，回收率显著下降。
5. 使用杂交扩增子WPRE-RPP30对双链病毒拷贝数检测进行准确性检查：尽管WPRE和RPP30的回收率未达到 100%，但 VCN 检测的最终测量值是WPRE拷贝数与RPP30拷贝数的归一化值。只要两者回收率相等，病毒拷贝数仍可准确测量。研究表明，该双链WPRE/RPP30 VCN 检测在 1.45×10⁵ - 7.38 的拷贝数范围内可准确量化整合到宿主细胞中的病毒基因组拷贝数，最佳输入拷贝数范围为 1000 - 10000。
6. 使用杂交扩增子WPRE-RPP30对 VCN 检测进行稳健性研究：为确定检测在潜在可变条件下的准确性，研究人员设计了稳健性研究，测试了限制酶 HindIII 的存在与否、输入拷贝数和限制酶预孵育时间三种条件。结果表明，预孵育限制酶 2 小时不影响 VCN 检测的准确性；HindIII 可有效切割杂交扩增子，使含有两种扩增子的液滴百分比降低，单扩增子液滴百分比增加，且不影响拷贝数定量的准确性。
7. 限制酶消化减少了雨的形成但不影响拷贝数定量的准确性：在 ddPCR 检测中，使用限制酶可减少 DNA 不必要的剪切，还可用于研究连接 DNA 的连锁分析。研究发现，HindIII 的存在减少了含有WPRE和RPP30两种扩增子的液滴（橙色液滴）百分比，增加了单扩增子液滴（蓝色和绿色液滴）百分比，降低了连锁得分，减少了雨的现象。雨虽存在，但不影响低拷贝数下 CNV 值的准确性，表明检测在极端条件下也具有稳健性。
8. 细胞参考和杂交扩增子之间的变异比较：建立细胞参考标准对监测细胞治疗开发过程中的检测变异性很重要，但耗时耗力，且细胞标准的克隆在培养几周后会发生变异。研究人员用表达抗 CD19 CAR 和 GFP 的慢病毒感染 Jurkat 细胞，建立细胞参考标准。结果显示，WPRE/RPP30检测可准确检测低至 1.56 ng 的转导细胞 gDNA 中的 VCN。与杂交扩增子相比，细胞标准在低 CNV 数下显示出相似的变异性，但可能无法区分生物和检测变异性，且在低拷贝数下日变化较小。

讨论

随着细胞和基因治疗的发展，标准化分析检测程序变得越来越必要。目前，虽然在流式细胞术检测的标准化方面取得了进展，但数字 PCR 仪器的标准验证方法尚未广泛应用。理想的 VCN 检测参考标准是感染已知拷贝数慢病毒的细胞，但创建这些细胞系需要大量资源，且存在细胞系代表性和批次间差异等问题。

商业参考材料是一种有吸引力的解决方案，WPRE-RPP30杂交扩增子可归类为商业参考材料。这种杂交扩增子不仅可用于简单的双链扩增，还可扩展应用于测试多重 ddPCR 检测，如检测单核苷酸多态性（SNPs）、表征复杂病毒载体（如腺相关病毒 AAV）以及进行染色体上两个连锁基因的里程分析等。

材料和方法

1. 参考材料的合成：本研究中使用的 gBlock 基因片段由 Integrated DNA Technologies 合成，包括WPRE gBlock 序列和WPRE-RPP30 gBlock 序列。
2. 慢病毒的制备：pLV-EF1A-CD19.8H.8TM.BB.3z 质粒（抗 CD19 嵌合抗原受体慢病毒载体）购自 addgene，病毒包装基于四质粒系统，由 Carrigent, Inc. 提供包装质粒，使用 PEI MAX 方法转染 293-T 悬浮适应细胞。
3. 慢病毒转导：Jurkat 细胞购自 ATCC，在 RP10 培养基中培养。200,000 个 Jurkat 细胞与慢病毒在含 6 μg/mL 聚凝胺的 RP10 培养基中孵育，离心后用 Attune NxT 流式细胞仪检测 GFP 表达。
4. 单细胞分选：使用 Wolf G2 细胞分选仪将 GFP⁺ Jurkat 细胞以单细胞分配模式分选到 96 孔板中，培养后筛选 GFP 表达。
5. 基因组 DNA 的分离：使用 QIAamp DNA mini 试剂盒（Qiagen）按照制造商说明分离基因组 DNA（gDNA），并在无核酸酶水中洗脱和稀释。
6. 液滴数字 PCR 检测：将杂交扩增子基因片段按照制造商协议在 IDTE 中重悬至 10 ng/mL，进行系列稀释。PCR 反应在 Air Clean 600 PCR 工作站中制备，使用含 2× ddPCR Supermix for Probes without dUTP、WPRE定制检测（FAM）、RPP30验证检测（HEX）和 HindIII（2,000 U/mL）的混合液。WPRE定制检测引物和探针浓度分别为 900 nM 和 250 nM，RPP30检测由 Bio-Rad 开发和验证，HindIII 购自 New England Biolabs。使用 Auto Droplet Generator（Bio-Rad）生成液滴，PCR 反应在 C1000 热循环仪（Bio-Rad）中进行，最后用 QX200 液滴读数仪（Bio-Rad）读取液滴。

数据可用性

研究数据可在文章及其补充信息中获取，如需原始和分析数据及材料，可向 Raymond Wu（[e-mail]）合理申请。

致谢

本研究部分由中美癌症基金会资助，作者感谢 John Nguyen 的有益讨论和建议。

作者贡献

R.W. 负责研究的概念设计、实验实施和结果解释，与 F.L. 共同撰写论文；S.K. 制备慢病毒；Y.Y. 提供建议和资金支持。

利益声明

作者声明无利益冲突。