靶向烟酰胺 N - 甲基转移酶（NNMT）的反义寡核苷酸展现抗肿瘤新希望

本文聚焦烟酰胺 N - 甲基转移酶（NNMT），其在肿瘤组织中高表达影响预后。研究制备 2′,4′ - BNA/LNA 修饰的反义寡核苷酸（ASOs）抑制 NNMT 表达，发现其在小鼠模型中有抗肿瘤效果，为新型抗癌药物研发提供方向。

　　

引言

烟酰胺 N - 甲基转移酶（Nicotinamide N - methyltransferase，NNMT）是一种代谢酶，它利用 S - 腺苷 - L - 甲硫氨酸（S - adenosyl - l - methionine，SAM）将烟酰胺甲基化，生成 1 - 甲基烟酰胺（1 - methyl - nicotinamide，1 - MNA）。烟酰胺作为 NAD⁺的重要原料，参与能量代谢，而 NNMT 通过调节 NAD⁺合成原料的供应，进而参与能量代谢过程。同时，SAM 是 DNA 甲基化和组蛋白甲基化所必需的物质，在表观遗传调控中发挥关键作用，NNMT 因消耗 SAM 也参与到表观遗传调控当中。

近年来，NNMT 作为潜在的抗癌药物靶点备受关注。在多种癌症中，NNMT 的异常表达与肿瘤的发生、发展密切相关。例如，在癌症相关成纤维细胞（cancer - associated fibroblasts，CAFs）中，NNMT 生成的 1 - MNA 被免疫细胞 T 细胞摄取后，会抑制干扰素 γ（Interferon gamma，IFN - γ）和肿瘤坏死因子 α（Tumor necrosis factor alpha，TNF - α）的表达，从而抑制 T 细胞功能，促进肿瘤生长 。在卵巢癌中，CAFs 特异性表达的 NNMT 会消耗 SAM，降低组蛋白甲基化水平 。在乳腺癌里，1 - MNA 与泛素结合酶 12（ubiquitin - conjugating enzyme 12，UBC12）结合，稳定 UBC12，增强 Neddylation 通路介导的 p27 降解，推动细胞周期进展 。在结直肠癌中，NNMT 主要在间质表达，早期高表达与不良预后相关 。在肝癌中，肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）中高表达的 NNMT 可改变组蛋白 H3K27 的甲基化模式，诱导 CD44 更稳定的剪接变体产生，导致肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的侵袭和转移 。在胰腺癌中，Hedgehog 信号通路激活，NNMT 是其靶点之一 。由此可见，NNMT 在肿瘤组织中的表达对肿瘤进展起着重要作用。本研究旨在制备 2′,4′ - BNA/LNA 修饰的 gapmer 硫代磷酸酯（PS）反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides，ASOs），作为 NNMT 的抑制剂，并探究其作为新型 NNMT 抑制剂的功能。

结果

1. 筛选针对 NNMT 的 ASO 序列：研究人员在前期整合了胰腺癌单细胞分析数据，构建了包含约 134,000 个细胞的胰腺癌细胞图谱。通过该图谱分析发现，NNMT 在 CAFs 中高表达。利用 Kaplan - Meier 绘图仪对 NNMT 表达的预后价值进行研究，结果显示，NNMT 高表达组的胰腺癌患者预后更差。鉴于 NNMT 是一种细胞内蛋白，难以用抗体靶向，本研究选择靶向 NNMT 编码 mRNA 的 18 聚体 gapmer ASOs 作为药物研发方式。将这些 gapmer ASOs 的所有磷酸二酯键替换为 PS 键，并在序列两端的侧翼区域引入三个 2′,4′ - BNA/LNA 修饰 。基于 RNAfold 预测的分子内二级结构，从 NNMT mRNA（NM_006169.3）的所有区域中提取非茎区。在与提取区域互补的 ASO 序列中，根据 GC% 预测其与 RNA 的结合亲和力，筛选出合适的 ASO 序列，同时确保 ASO 自身不易形成分子内茎或聚合物。此外，借助 GGGenome（https://gggenome.dbcls.jp/ ）和 Database for Drug Development with Genome and RNA sequences（D3G，https://d3g.riken.jp/ ）数据库，排除那些与大量基因存在两个或更少插入 / 缺失 / 错配序列的 ASO。最终筛选出 8 条 ASO 序列。
2. ASO 对 NNMT 表达的抑制作用：为检测 ASO 对 NNMT 表达的抑制效果，研究人员选用人结直肠腺癌细胞系 HT29，采用逆转录定量聚合酶链反应（RT - qPCR）评估 NNMT 的表达。与对照组相比，这 8 条 ASO 均能降低 NNMT 的 mRNA 表达水平。在 200 nM ASO 浓度条件下，NNMT 的表达水平低于 50 nM 条件，其中 hNNMT - 897 - LNA (18) 的抑制效果最为显著。因此，hNNMT - 897 - LNA (18) 被选定为最终的候选序列。
3. 构建靶向 CAF 的 ASO 并评估其抗肿瘤效果：为了使 ASO 能够靶向 CAF，研究人员利用胰腺癌小条件 RNA 测序（scRNA - seq）数据，分析了 CAF 的细胞表面蛋白，发现成纤维细胞激活蛋白（fibroblast activation protein，FAP）在 CAF 中特异性表达。于是，将 FAP 结合化合物 FAPI - 04 与 ASO 进行偶联，赋予 ASO 特异性结合并被 CAF 摄取的功能 。通过高效液相色谱（HPLC）对该 ASO 进行合成与纯化。随后，在小鼠异种移植模型中评估其疗效。将人胰腺癌细胞系 MIA PaCa - 2 细胞和表达 FAP 的小鼠成纤维细胞 3T3 细胞皮下注射到小鼠体内，然后静脉注射 FAPI - 04 偶联的 ASO。实验结果表明，与仅接受 5 - 氟尿嘧啶（5 - fluorouracil，5 - FU）和免疫检查点抑制剂（PD - 1 抗体和 CTLA4 抗体）治疗的组相比，接受 ASO 联合 5 - FU 和免疫检查点抑制剂治疗的组，其抗肿瘤效果得到增强。
4. ASO 处理后癌细胞基因表达的变化：为探究 ASO 给药后癌细胞基因表达的变化，研究人员从实验小鼠体内切除癌组织，提取 RNA 并进行 RNA 测序，获取基因表达数据。结果发现，RN7SL3、RN7SL2、RN7SL767P、RN7SL5P 和 RN7SL4P 等基因高表达，而 TMEM230、UAP1、SH3BGRL3、TXNDC17 和 ADAM15 等基因低表达。通过基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）确定受 ASO 给药影响的信号通路，结果显示，病毒心肌炎、扩张型心肌病、钙信号通路、肥厚型心肌病、紧密连接、核糖体、致心律失常性右室心肌病、系统性红斑狼疮、黑色素生成和黏着连接等通路上调；卟啉和叶绿素代谢、碱基切除修复、氨酰 - tRNA 生物合成、DNA 复制、囊泡运输中的 SNARE 相互作用、嘧啶代谢、错配修复、丁酸代谢、核苷酸切除修复和膀胱癌等通路下调。实际上，在 FAPI - 04 偶联的 ASO 处理组中，MYC、细胞周期蛋白 D1（Cyclin D1，CCND1）、蜗牛家族转录抑制因子 2（snail family transcriptional repressor 2，SNAI2）、转化生长因子 β2（transforming growth factor β 2，TGF - β2）和 DNA 错配修复（DNA mismatch repair，MMR）基因之一的 MutL 同源物 1（MutL homolog 1，MLH1）等癌症相关基因的表达均下调。
5. FAPI - 04 偶联的 ASO 对其他细胞系的作用：研究人员还检测了 FAPI - 04 偶联的 ASO 对非小细胞肺癌（non - small - cell lung carcinoma，NSCLC）来源的 A549 细胞系的抗肿瘤效果，发现当浓度为 1,000 nM 时，A549 细胞的活力下降。将 FAPI - 04 偶联的 ASO 对 A549 细胞的生长抑制作用与现有的 NNMT 抑制剂 6 - 甲氧基烟酰胺（JBSNF - 00088）进行比较，结果表明二者效果相当。此外，对人肺成纤维细胞 MRC - 5 进行的增殖实验显示，FAPI - 04 偶联的 ASO 能够抑制其增殖，且效果与 JBSNF - 00088 相近。当用含有 FAPI - 04 偶联的 ASO 或 JBSNF - 00088 的培养基培养 MRC - 5，然后将培养上清液提供给 A549 细胞时，A549 细胞的生长受到抑制。这些结果均表明，靶向 NNMT 的 ASO 具有抗肿瘤作用。

讨论

本研究致力于研发靶向 NNMT 的 ASO 药物。在胰腺癌中，NNMT 主要在 CAFs 中表达，因其对预后的重要影响而成为备受关注的靶点。ASO 抑制 NNMT 表达后展现出抗肿瘤效果，这充分证明 NNMT 是一个极具潜力的药物研发靶点。研究最终筛选出 8 条 ASO，其中 hNNMT - 897 - LNA (18) 对 NNMT 的抑制活性最强，这表明针对不同的 mRNA 靶点位置，ASO 的抑制效果存在差异。

FAPI - 04 是一种能与 FAP 紧密结合的小分子化合物，将其与 ASO 偶联可实现对表达 FAP 细胞的靶向作用。在异种移植小鼠模型中，FAPI - 04 偶联的 ASO 展现出抗肿瘤效果，这说明对 FAPI - 04 进行单一修饰就足以发挥作用。这种单一修饰在药物合成过程中，对提高产量和便于质量控制具有重要意义。

已有研究表明 NNMT 参与表观遗传调控 。本研究观察到 FAPI - 04 偶联的 ASO 可下调 MYC 的表达，而 MYC 已被证实受到表观遗传调控 ，这意味着 FAPI - 04 偶联的 ASO 可能通过抑制 NNMT 的表达来影响表观遗传调控。此外，SNAI2 和 TGFB2 参与上皮 - 间质转化（epithelial - mesenchymal transition，EMT） ，这表明 FAPI - 04 偶联的 ASO 可能通过抑制它们的表达来抑制肿瘤转移。

虽然已有研究报道 NNMT 抑制剂 JBSNF - 000088 在 NSCLC 来源的 PC9 细胞系中具有抗肿瘤作用 ，但在本研究中，针对 A549 细胞系，1,000 nM 的 JBSNF - 000088 与 FAPI - 04 偶联的 ASO 的细胞活力相当。这表明 FAPI - 04 偶联的 ASO 不仅适用于胰腺癌，对其他类型的癌症也可能具有治疗效果。

在 ASO 处理组的癌细胞中，7SL RNA 家族基因的表达增加。7SL RNAs 是构成信号识别颗粒的 RNA，可识别分泌蛋白和膜蛋白的翻译过程，并将它们招募到内质网 。有研究报道 7SL RNA 能够激活免疫 ，并且在致癌情况下可能表达微肽 。因此，ASO 给药可能激活了 7SL RNA，从而产生抗肿瘤效果。综上所述，靶向 NNMT 的 ASO 有望成为一种极具潜力的抗癌药物。

材料和方法

1. 利用 scRNA - seq 数据进行基因表达分析：研究人员使用之前构建的数据库分析胰腺癌组织中 NNMT 和 FAP 的表达。将 pk_all.rds 文件加载到 R Seurat 中，通过 FeaturePlot 展示 NNMT 和 FAP 的表达情况。
2. 绘制 NNMT 的 Kaplan - Meier 曲线：根据 Kaplan - Meier 绘图仪数据库中胰腺癌 RNA 测序数据，绘制 NNMT 的 Kaplan - Meier 曲线。
3. 基于细胞的 NNMT 抑制实验的 RT - qPCR：将 HT29 细胞（美国典型培养物保藏中心，Manassas）以每孔 2,000 个细胞的密度接种于 96 孔板，在含有 10% 胎牛血清（日本东京 Cosmo Bio Co., Ltd.）的 McCoy's 5a 培养基（美国赛默飞世尔科技，Chino）中培养 1 天。然后更换为含有 10% 胎牛血清的 DMEM 低糖培养基（日本京都 Nacalai Tesque, Inc.），采用培养基 Ca^{2 +}富集（CEM）法转染 ASO，并继续培养 1 天。收集细胞，使用 TOYOBO 公司（日本大阪）的 SuperPrep Cell Lysis & RT Kit for qPCR 制备 cDNA，再用赛默飞世尔科技（美国 Chino）的 Power UP SYBR Green Master Mix for qPCR 进行 RT - qPCR。反应条件为：95°C 预热 20 s，95°C 变性 3 s，60°C 延伸 30 s，变性和延伸步骤重复 45 个循环。以 200 nM 的 GAPDH 正向引物（5′ - GAGTCAACGGGATTTGGTCGT - 3′）和 GAPDH 反向引物（5′ - GACAAGCTTCCCGTTCTCAG - 3′）作为内参；以 200 nM 的 NNMT 正向引物（5′ - GCTGAAGAAAGAGAGCCAGAGAGG - 3′）和 NNMT 反向引物（5′ - GAGTCACATCACACTTCAGCAC - 3′）用于 NNMT 的定量。NEG#L25（5′ - AGA CTCTGAACA AAA - 3′）作为阴性对照 ASO（下划线大写字母表示 2′,4′ - BNA/LNA，大写字母表示 DNA，所有核苷酸间连接均为 PS 键）。除 FAPI - 04 偶联的 ASO 外，其他 ASO 和 qPCR 引物均购自日本茨城的 GeneDesign, Inc.。
4. HPLC 纯化和 MALDI - TOF 质谱表征：使用日本京都岛津公司的 SHIMADZU CBM - 20A、DGU - 20A_5R、LC - 20AD、CTO - 20A、SPD - 20A 和 FRC - 10A 设备进行相关操作。通过美国威尔明顿 DeNovix 公司的微体积紫外 - 可见分光光度计 DeNovix DS - 11 在 260 nm 波长处记录的峰值计算偶联产率。利用美国比勒里卡布鲁克公司的 BRUKER Daltonics autoflex maX TOF/TOF 质谱仪记录 FAPI - 04 偶联的 ASO 的基质辅助激光解吸电离飞行时间（MALDI - TOF）质谱。
5. 动物实验：小鼠实验经大阪大学动物实验委员会批准后开展。将 FAP 表达质粒转染到小鼠 NIH/3T3 Tet - On 3G 细胞系（美国山景城 Clontech 公司）中，该质粒由美国新泽西州 GenScript 公司合成的 FAP 基因插入到 pTRE - Dual2 载体（美国山景城 Clontech 公司）的 Bam HI（日本东京 NIPPON GENE 公司）和 Sal I（日本东京 NIPPON GENE 公司）位点之间构建而成。将 5 × 10⁶个 MIA PaCa - 2 细胞（美国典型培养物保藏中心，Manassas）、2.5 × 10⁶个表达 FAP 的小鼠 3T3 细胞、10% 康宁 Matrigel 生长因子减少（GFR）无 LDEV 基底膜基质（美国康宁公司）和 1 μg/mL 强力霉素溶解在含有 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基中，作为 250 μL 细胞溶液皮下注射到小鼠背部。实验小鼠为 NOD/SCID 小鼠（日本东京 CLEA Japan, Inc.）。在细胞移植后的第 3、5、7 和 10 天，静脉注射 200 μg 5 - FU（溶解在 PBS 中，浓度为 10 mg/mL，日本大阪 FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.）、93.5 μg PD - 1 抗体（美国黎巴嫩 Bio X Cell 公司）、90.6 μg CTLA4 抗体（美国黎巴嫩 Bio X Cell 公司）和 ASO。移植后用卡尺测量肿瘤大小，肿瘤体积计算公式为：长轴 × 短轴 × 短轴 ×0.5。
6. RNA 测序：用日本东京 NIPPON GENE 公司的 ISOGEN 从切除的小鼠肿瘤组织中提取 RNA，并将 RNA 测序工作委托给大阪大学微生物疾病研究所的基因组分析实验室。使用美国山景城 Clontech 公司的 SMART - Seq HT Kit 和美国圣地亚哥 Illumina 公司的 Nextera XT 制备文库，采用 NovaSeq6000 以 101 bp 双端模式进行 RNA 测序。利用日本东京 Rhelixa 公司的 RNA 测序流程（Rhelixa’s RNA - seq pipeline）对所得的 FASTQ 文件进行后续处理，该流程包括使用 FastQC 进行质量检查、用 Trimmomatic 进行序列修剪、用 Hisat2 进行序列比对以及用 featureCounts 进行基因表达分析。通过网站分析软件 BioJupies（https://maayanlab.cloud/biojupies/analyze ）绘制火山图。使用 GSEA 软件（https://www.gsea - msigdb.org/gsea/index.jsp ），基于 BioJupies 中获得的表达可变基因数据进行基因集富集分析（GSEAPreranked）。
7. 细胞增殖实验：为测定 A549 细胞系（美国典型培养物保藏中心，Manassas）和 MRC - 5 细胞系（由 Murakumo 博士惠赠