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本文聚焦肝癌（HCC），发现 E3 泛素连接酶 TRIM6 在肝癌组织中显著上调，与不良预后相关。STAT3 可直接调控 TRIM6，而 TRIM6 通过降解 DDX58，解除其对 Snail1 的抑制，促进上皮 - 间质转化（EMT）和细胞侵袭，为肝癌治疗提供新方向。
肝癌研究背景
肝癌（HCC）是全球常见且致命的癌症之一，尽管早期检测和治疗策略有所进展，但因其侵袭性强、复发率高和预后差，仍是重大健康挑战。其进展和转移的分子机制复杂，涉及多种信号通路失调、基因组不稳定和肿瘤微环境等因素。其中，泛素 - 蛋白酶体系统（UPS）的失调在肿瘤发生和进展中起重要作用，E3 泛素连接酶的异常表达可促进肿瘤抑制因子降解和致癌蛋白稳定，影响肿瘤发展。
研究目的
本研究旨在探究 TRIM6 在肝癌中的作用及其潜在机制，明确其是否可作为治疗靶点，为肝癌治疗提供新方向。研究人员假设 TRIM6 可能通过泛素化调节 DDX58，影响上皮 - 间质转化（EMT）和肿瘤转移，围绕这一假设展开了系列实验。
材料和方法
- 筛选差异表达基因（DEGs）：利用 GSE50579 和 GSE112791 两个公开微阵列数据集，从基因表达综合数据库（GEO）下载原始数据，用 R 语言和 Bioconductor 包预处理，以 p 值＜0.05 和 | log2 倍变化（log2FC）|＞1.5 为标准筛选差异表达基因，用 ggplot2 包绘制火山图，VennDiagram 包构建维恩图。
- 富集分析：用 clusterProfiler 包对 TRIM6 敲除与野生型细胞（GSE138841 数据集）的差异表达基因进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析，p 值＜0.05 且错误发现率（FDR）＜0.25 为显著富集，用 enrichplot 包绘制柱状图和点图。
- 转录因子结合位点预测：使用 TF_Target_Finder 在线工具预测调控 TRIM6 表达的潜在转录因子，该工具整合多个数据库数据，发现 STAT3 可能调控 TRIM6。
- 分子对接模拟：获取 TRIM6 和 DDX58 的三维结构，无晶体结构时用 Alphafold3 模型预测，用 AutoDock Vina 进行对接模拟，以预测相互作用界面，用 PyMOL 软件可视化结合相互作用。
- 生存分析：通过 Kaplan - Meier Plotter 数据库对肝癌患者进行生存分析，根据 TRIM6 表达中位数分组，用对数秩检验比较两组总生存期（OS），p 值＜0.05 为有统计学意义。
- 细胞实验相关操作
- 细胞培养：肝癌细胞系 HCCLM3 和 Huh - 7 来自中国科学院细胞库，在含 10% 胎牛血清、青霉素和链霉素的杜氏改良 Eagle 培养基（DMEM）中，37℃、5% CO?条件下培养，每 2 - 3 天传代。
- 基因敲低和过表达：用慢病毒介导的短发夹 RNA（shRNAs）敲低 TRIM6 和 DDX58，将其编码序列亚克隆到 pcDNA3.1 (+) 载体实现过表达，转染后用 qRT - PCR 和蛋白质免疫印迹法验证效率。
- RNA 提取和 qRT - PCR：用 TRIzol 试剂提取 RNA，NanoDrop 2000 分光光度计测浓度和纯度，PrimeScript RT 试剂 Kit 合成 cDNA，TB Green Premix Ex Taq II 进行 qRT - PCR，以 GAPDH 为内参，用 2?ΔΔCt法计算基因表达倍数变化。
- 蛋白质免疫印迹（Western blotting）：细胞用含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的 RIPA 缓冲液裂解，BCA 蛋白测定试剂盒测蛋白浓度，SDS - PAGE 分离蛋白并转膜，用相应抗体孵育，ECL Plus Western Blotting Detection System 显色，ImageJ 软件进行密度分析。
- 荧光素酶报告基因检测：扩增 TRIM6 启动子区域构建野生型和突变型荧光素酶报告基因载体，与 STAT3 表达质粒或对照载体共转染细胞，用 Dual - Luciferase Reporter Assay System 检测荧光素酶活性，以海肾荧光素酶活性为内参，计算相对荧光素酶活性。
- 染色质免疫沉淀（ChIP）实验：用 EZ - Magna ChIP A/G Kit 进行 ChIP 实验，用抗 STAT3 抗体或正常兔 IgG 孵育染色质，qPCR 分析 STAT3 与 TRIM6 启动子区域结合情况，用 2?ΔΔCt法分析数据，结果以输入染色质百分比表示。
- 免疫共沉淀（Co - IP）：细胞裂解后用蛋白 A/G 磁珠预清除，与抗 TRIM6 或抗 DDX58 抗体孵育，用蛋白 A/G 磁珠捕获免疫复合物，Western blotting 分析结合蛋白。
- Transwell 侵袭实验：用预包被 Matrigel 的 24 孔 Transwell 侵袭小室评估细胞侵袭能力，上室加无血清 DMEM 悬浮细胞，下室加含 10% FBS 的 DMEM，孵育后固定、染色、计数侵袭细胞。
- 统计分析：实验重复至少三次，数据以均值 ± 标准差（SD）表示，两组比较用 Student’s t 检验，多组比较用单因素方差分析（ANOVA）和 Tukey’s 事后检验，生存分析用对数秩检验，p 值＜0.05 为有统计学意义，用 GraphPad Prism 8.0 软件分析。
研究结果
- TRIM6 上调与肝癌不良预后相关：分析两个微阵列数据集，发现 TRIM6 在肝癌组织中显著上调，在多个队列中得到验证，且与肿瘤分级和分期相关。Kaplan - Meier 生存分析显示，高表达 TRIM6 的肝癌患者总生存期较差，表明 TRIM6 可作为潜在预后生物标志物和治疗靶点。
- STAT3 直接调控肝癌中 TRIM6 表达：预测 STAT3 可能调控 TRIM6，分析 TCGA 数据发现二者表达呈正相关。构建荧光素酶报告基因载体实验表明，STAT3 可通过结合 TRIM6 启动子增强其活性，ChIP 实验证实 STAT3 直接结合 TRIM6 启动子区域。抑制或过表达 STAT3 影响 TRIM6 的 mRNA 和蛋白水平，表明 STAT3 是 TRIM6 表达的关键调节因子。
- TRIM6 促进肝癌中上皮 - 间质转化（EMT）和细胞侵袭：分析 GSE138841 数据集，发现 TRIM6 敲除影响多个基因表达，基因集富集分析（GSEA）显示其激活多个生物通路，包括 EMT 通路。GO 和 KEGG 富集分析表明，TRIM6 敲除后下调的基因与细胞外结构组织等过程和 ECM - 受体相互作用等通路相关。在肝癌细胞系中，敲低 TRIM6 降低 Snail1 表达和细胞侵袭能力，过表达则相反，表明 TRIM6 通过调节 Snail1 促进 EMT 和细胞侵袭。
- TRIM6 与 DDX58 相互作用并促进其降解：BioGRID 数据库分析显示 DDX58 可能与 TRIM6 相互作用，Co - IP 实验证实二者在肝癌细胞中存在物理相互作用，Alphafold3 预测了相互作用界面。过表达 TRIM6 降低 DDX58 蛋白水平但不影响其 mRNA 水平，敲低 TRIM6 则相反，CHX chase 实验表明 TRIM6 促进 DDX58 降解，TUBE2 pulldown 实验证明 TRIM6 促进 DDX58 泛素化，STAT3 抑制剂处理增加 DDX58 蛋白表达，表明 STAT3 通过调节 TRIM6 间接影响 DDX58 稳定性。
- DDX58 介导 TRIM6 对肝癌中 Snail1 表达和细胞侵袭的影响：同时敲低 TRIM6 和 DDX58 可恢复 Snail1 表达和细胞侵袭能力，过表达 TRIM6 和 DDX58 则抑制 Snail1 表达和细胞侵袭，表明 DDX58 是 TRIM6 调节 Snail1 表达和细胞侵袭的关键介质。
讨论
本研究表明 TRIM6 在肝癌进展中起重要作用，其上调与不良临床结局相关。STAT3 是 TRIM6 的直接上游调节因子，二者构成的信号通路在肝癌发生中起关键作用。此外，TRIM6 通过促进 EMT 和细胞迁移发挥致癌作用，机制是上调 Snail1 并降解 DDX58，解除 DDX58 对 Snail1 和 EMT 的抑制。STAT3 间接调节 DDX58 蛋白稳定性，通过激活 TRIM6 促进 DDX58 降解。
本研究整合多数据集验证了 TRIM6 的作用，明确了 STAT3 - TRIM6 - DDX58 - Snail1 通路，但仍存在局限性。未来需进一步探索 TRIM6 的调控网络，评估其在体内的功能和对肝癌转移的影响，研究靶向该通路的治疗潜力，为肝癌治疗提供新策略。总之，本研究揭示的这条信号通路为理解肝癌进展机制和开发新疗法提供了重要依据。
