Smad4 与 TGF-β1 调控肠腺瘤及结直肠癌的基因表达密码

在癌症研究领域，TGF-β 信号通路的突变影响复杂。为探究其机制，研究人员以小鼠为模型，开展 Smad4 和 TGF-β1 相关基因表达研究。结果发现二者影响肠腺瘤表型和基因表达，相关基因还与结直肠癌预后有关。这为癌症研究提供新方向。

　　在癌症的神秘世界里，TGF-β（转化生长因子 -β ） -BMP（骨形态发生蛋白） -SMAD4 信号通路就像一把双刃剑。正常情况下，TGF-β 配体可抑制细胞生长，但在下游通路发生突变时，却能反常地促进癌症的侵袭和转移，尤其是 SMAD4 基因发生改变时。这种复杂的现象让科研人员十分着迷，也充满了挑战。目前，虽然有全基因组测序、基因水平 RNA 测序和蛋白质组学生物标志物等技术用于结直肠癌的研究，但与 TGF-β -BMP -SMAD4 通路活性相关的特异性基因表达生物标志物却十分匮乏。这就好比在黑暗中摸索，却缺少关键的照明工具，严重阻碍了对癌症发生发展机制的深入理解和精准治疗的探索。为了打破这一困境，来自牛津大学（University of Oxford）的研究人员决定深入研究 Smad4 和 TGF-β1 在肠腺瘤和结直肠癌中的作用机制。
研究人员巧妙地构建了条件性小鼠肠腺瘤模型，通过改变 Smad4 基因状态，观察肠腺瘤的生长变化和基因表达特征。同时，利用体外培养的腺瘤类器官，研究 TGF-β1 对细胞生长、死亡和基因表达的影响。此外，他们还对人类结直肠癌数据进行分析，寻找与小鼠模型中相关基因表达变化一致的特征。最终，研究人员发现，在小鼠模型中，同时敲除 Apc 和 Smad4 基因会导致肠腺瘤出现不一致的表型，小肠腺瘤数量减少，而盲肠腺瘤却异常增大。在类器官实验中，TGF-β1 对 Smad4^+/+和 Smad4^Δ/Δ的腺瘤类器官生长抑制作用存在显著差异，且 TGF-β1 处理后，二者的基因表达谱也有所不同，其中 Id1 和 Spp1 基因的表达变化最为明显。在人类结直肠癌中，虽然只有少数小鼠模型中的差异表达基因在 SMAD4 突变的情况下也表现出差异，但 ID1、SPP1 和 PAK3 的表达与患者的生存结局相关。这些发现为结直肠癌的研究提供了新的方向和潜在的生物标志物，有助于开发更精准的癌症诊断和治疗方法。该研究成果发表在《Scientific Reports》上。
研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：一是构建条件性 Cre 肠腺瘤小鼠模型，通过特定的基因编辑技术，使小鼠体内的 Apc 和 Smad4 基因发生条件性敲除；二是进行肠道腺瘤类器官培养，将小鼠体内形成的腺瘤在体外培养成类器官，以便更直观地研究其生长和对 TGF-β1 的反应；三是利用单细胞 RNA 测序技术，对盲肠腺瘤进行单细胞层面的基因表达分析；四是对 TCGA（癌症基因组图谱）数据库中的结直肠癌数据进行分析，对比小鼠模型和人类癌症数据之间的联系。
下面来详细看看研究结果：

• 联合 Apc 和 Smad4 条件性敲除导致不一致的腺瘤表型：研究人员将带有条件性等位基因的小鼠进行杂交，通过注射他莫昔芬激活 Cre 重组酶，诱导 Apc 和 Smad4 基因的敲除。结果发现，敲除 Smad4 基因后，小鼠的生存情况有所改善，小肠腺瘤数量明显减少，而盲肠腺瘤却出现异常增大的现象。通过免疫组化和免疫印迹实验，证实了 Smad4 基因的敲除效率以及 TGF-β（BMP）信号通路的激活情况。
• 联合 Apc 和 Smad4 敲除改变腺瘤类器官的生长：研究人员从 Smad4^Δ/Δ和 Smad4^+/+的盲肠腺瘤中分离出细胞，在基质胶中培养成类器官。研究发现，Smad4^Δ/Δ的腺瘤类器官在体外生长较慢，且对 TGF-β1 的敏感性低于 Smad4^+/+的腺瘤类器官。进一步研究表明，这是由于 Cre 介导的 Smad4 基因重组导致其 MH1 结构域缺失，产生了无法进入细胞核的截短蛋白。
• TGF-β1 对 Smad4^Δ/Δ腺瘤类器官的剂量依赖性：研究人员在腺瘤类器官培养中添加不同剂量的 TGF-β1，发现 TGF-β1 对 Smad4^+/+和 Smad4^Δ/Δ的腺瘤类器官生长抑制作用存在 20 倍的差异敏感性。Smad4^+/+的腺瘤类器官对 TGF-β1 更为敏感，IC₅₀为 24pM，而 Smad4^Δ/Δ的腺瘤类器官 IC₅₀为 534pM。此外，TGF-β1 处理还导致了两种腺瘤类器官在形态、增殖和凋亡等方面的不同变化。
• TGF-β1 和 Smad4 依赖的 Id1 和 Spp1 基因在腺瘤类器官中的表达：通过对 TGF-β1 处理后的腺瘤类器官进行批量配对末端 RNA 测序，研究人员发现了许多差异表达基因。其中，Id1 在 Smad4^Δ/Δ的腺瘤类器官中表达明显降低，而 Spp1 则显著升高。这些基因表达的变化与细胞增殖、分化和 TGF-β 信号通路等密切相关。
• TGF-β1 依赖的基因表达与蛋白质的相关性：研究人员对一些基因的表达和蛋白质水平进行了检测，发现虽然基因表达发生了变化，但部分蛋白质的表达和定位并没有与之呈现明显的相关性。这表明在这种情况下，蛋白质丰度可能受到多种因素的调控，不能简单地作为 mRNA 基因表达的可靠替代指标。
• Smad4^fl/fl盲肠腺瘤的单细胞 RNA 测序显示 Pak3^Hi上皮祖细胞富集：对盲肠腺瘤进行单细胞 RNA 测序分析发现，Smad4^fl/fl的腺瘤中 Pak3^High和 Slc14a1^High基因表达增加，且在祖细胞上皮细胞中相对富集。而 Lgr5^ISC等其他细胞群在两种基因型中的比例存在差异。
• Smad4 依赖的 ID1、SPP1 和 PAK3 在人类结直肠癌中的表达：研究人员分析了 TCGA 数据库中的人类结直肠癌数据，发现小鼠腺瘤中鉴定出的 76 个差异表达基因中，只有 7 个在人类结直肠癌中也表现出与 SMAD4 突变相关的差异表达，其中 ID1 最为显著。此外，SMAD4、ID1、SPP1 和 PAK3 的 mRNA 表达与结直肠癌患者的生存结局相关，高表达 SPP1 和 PAK3、低表达 ID1 与较差的生存预后相关。
  研究结论表明，在小鼠肠腺瘤模型中，Smad4 和 TGF-β1 显著影响腺瘤的表型和基因表达。在人类结直肠癌中，虽然小鼠模型中的部分基因表达变化在人体中得到了一定的验证，但由于小鼠和人类在发育、生理和基因表达调控等方面存在差异，仍需要进一步研究。然而，SMAD4、ID1、SPP1 和 PAK3 的 mRNA 表达与结直肠癌患者的生存结局相关，这为未来研究肠道癌症亚型的预后预测分类器提供了重要的候选功能指标。该研究为深入理解 TGF-β -BMP -SMAD4 通路在癌症发生发展中的作用机制提供了新的视角，为开发更有效的癌症诊断和治疗方法奠定了基础。同时，也为后续研究如何利用这些生物标志物进行精准治疗指明了方向，具有重要的理论和临床意义。