编辑推荐：
耐药结核病（DR - TB）严重威胁人类健康，传统药敏诊断耗时久。研究人员开展基于微流控芯片和显微镜技术的结核分枝杆菌药敏试验研究，12 小时内即可完成对牛型卡介苗（BCG）的表型药敏试验（pDST），有助于加快诊断、优化治疗方案，意义重大。
结核病（TB），这个古老而又顽固的病魔，千百年来一直纠缠着人类，如今更是成为全球公共卫生的重大威胁。随着新冠疫情的缓和，结核分枝杆菌（Mtb）这位 “隐藏杀手” 再次浮出水面，重新占据全球传染病致死原因的榜首。据统计，2023 年约有 1080 万人感染结核病，125 万人因此失去生命。而耐药结核病（DR - TB），包括多药耐药结核病（MDR - TB）、广泛耐药结核病（XDR - TB）等，更是让结核病的治疗雪上加霜。每年约 20 万人因耐药结核病丧生，治疗耐药结核病不仅费用高昂、疗程漫长，而且死亡率居高不下。
在结核病的诊断过程中，药物敏感性测试（DST）至关重要，它能够帮助医生选择最合适的治疗方案，避免无效用药，减少耐药菌的传播。然而，目前的诊断方法存在诸多缺陷。基因型药敏测试（gDST）虽然快速，但在实际操作中，其结果获取时间仍需 1 - 10 个工作日，且费用昂贵，在资源匮乏地区难以普及，对一些新型药物的耐药检测也存在局限。而表型药敏测试（pDST），作为目前的金标准，虽然可靠，但基于液体或固体培养基的检测方法耗时极长，液体培养至少需要两周，固体培养基检测则超过 21 天，漫长的检测周期极易导致患者产生获得性耐药，严重影响治疗效果。
为了打破这一困境，瑞典乌普萨拉大学（Uppsala University）的研究人员开展了一项极具创新性的研究。他们利用微流控芯片、单细胞成像以及基于深度神经网络（DNN）的图像分析技术，对生长缓慢的结核分枝杆菌模型牛型卡介苗（BCG）和生长快速的非结核分枝杆菌模型耻垢分枝杆菌进行研究，旨在实现快速的表型药敏测试。这项研究成果发表在《Nature Communications》上，为结核病的诊断和治疗带来了新的希望。
研究人员在此次研究中运用了多种关键技术方法。首先是微流控芯片技术，他们设计并制作了特殊的微流控芯片，芯片上有两排微腔作为细胞捕获装置，能够将细菌细胞限制在特定区域，方便后续观察。其次，采用单细胞成像技术，使用尼康倒置显微镜对细菌细胞进行成像，通过不同的相机分别对牛型卡介苗和耻垢分枝杆菌进行拍摄，获取细胞生长的图像数据。最后，利用基于深度神经网络的图像分析技术，运用 Omnipose 算法对图像进行处理和分析，从而实现对细胞生长速率的精确量化。
快速表型药敏测试
研究人员将液体培养的细菌样本加载到微流控芯片的微腔中，通过相差显微镜监测不同抗生素作用下细胞的生长情况。根据牛型卡介苗和耻垢分枝杆菌生长速率的差异，分别设定了不同的测量时间。对于牛型卡介苗，先在无药培养基中培养 3 小时，再加入药物培养 24 小时；对于耻垢分枝杆菌，则是无药培养 1 小时，加药培养 3 小时。通过监测细胞总面积的变化来评估生长情况，发现可以在短时间内检测到药物处理组和对照组之间的生长速率差异。例如，对于牛型卡介苗，在 3 小时内就能检测到药物处理组和对照组在生长速率上的显著差异；对于耻垢分枝杆菌，这个时间更短，不到 1 小时。
数据分析
由于缺乏精确的分枝杆菌细胞分割工具，研究人员使用 Omnipose 算法并训练新模型对细胞进行分割。他们创建了包含 120 张图像的训练数据集，涵盖不同实验条件下的牛型卡介苗和耻垢分枝杆菌细胞图像。通过对比分割结果与真实标注，评估模型性能。结果显示，新模型在分割低细胞密度数据时表现出色，相比默认模型有显著提升，但在处理高细胞密度数据时仍存在一定问题。
快速检测药物治疗反应
研究人员用快速 pDST 测定了牛型卡介苗和耻垢分枝杆菌对多种药物的反应。对于牛型卡介苗，在 10 倍最低抑菌浓度（MIC）的利福平（RIF）、1 倍 MIC 的异烟肼（INH）、乙胺丁醇（EMB）和利奈唑胺（LZD）作用下，3 小时内就能检测到处理组和对照组生长速率的显著差异。对于耻垢分枝杆菌，在相应药物作用下，不到 1 小时就能检测到生长速率差异。不同抗生素的反应曲线形状不同，这表明反应时间受细胞生物学特性限制，而非测量技术的问题。
贝达喹啉（BDQ）相关问题
在研究 BDQ 对细菌生长的影响时，发现使用普通管路时，BDQ 对耻垢分枝杆菌和牛型卡介苗的生长抑制作用会逐渐减弱。但更换为更具化学惰性的氟化乙烯丙烯（FEP）管路后，BDQ 能有效抑制敏感耻垢分枝杆菌的生长，在 1 倍 MIC 时就能发挥作用。
耐药菌株检测
研究人员对耐 RIF、INH 和 LZD 的耻垢分枝杆菌菌株进行 pDST 测试，并与敏感的亲本菌株对比。结果表明，耐药菌株和敏感菌株在 3 小时内就能通过快速 pDST 可靠地区分。对于牛型卡介苗俄罗斯株，在使用世界卫生组织（WHO）推荐的治疗结核病及耐药结核病药物的临界浓度（CCs）进行测试时，6 小时后就能观察到敏感菌株和耐药菌株（如耐 RIF、链霉素（STR）、氟喹诺酮（FQ））在生长速率上的差异。
异质性耐药检测
研究人员通过将敏感的牛型卡介苗俄罗斯野生型菌株与耐药菌株按 99:1 的比例混合，加载到微流控芯片上进行检测。结果发现，利用该技术的高通量和高时空分辨率，能够在 1% 的检测限下检测到异质性耐药感染。
这项研究成功实现了对快速生长和缓慢生长的分枝杆菌的快速 pDST，能够在短时间内区分敏感菌株和耐药菌株，还具备检测异质性耐药的潜力。这一成果有助于缩短结核病诊断的周转时间（TAT），加快药敏测试进程，实现更有效的药物反应监测，从而帮助医生为患者选择更合适的药物组合和剂量，提高治疗效果，减少耐药菌的传播，为全球结核病防控工作提供了有力的技术支持。然而，目前该方法仍处于研究阶段，未来需要进一步优化，实现临床应用的转化，如在封闭系统中实现流体自动化，对临床样本中的高毒力和耐药结核分枝杆菌进行测试，以更好地服务于结核病患者。
