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在呼吸道病毒威胁全球健康的当下，TTSPs 成为抗病毒及抗癌药物研发关键靶点。研究人员聚焦 TMPRSS11D 和 TMPRSS2，发现其能自切割激活，开发出相关抑制剂，并揭示现有抑制剂的优劣，为靶向这些蛋白酶的药物研发提供重要依据。
在全球公共卫生领域，人类呼吸道病毒一直是严重的威胁。尤其是新冠病毒（SARS-CoV-2）引发的 COVID-19 大流行，更是让人们深刻意识到，当呼吸道病毒疫苗尚未研发出来时，急需有效的抗病毒疗法。在寻找抗病毒药物靶点的过程中，一类位于细胞表面的人类蛋白酶 ——II 型跨膜丝氨酸蛋白酶（Type II Transmembrane Serine Proteases，TTSPs）进入了科学家的视野。TTSPs 在 SARS-CoV-2 等病毒进入细胞并引发感染的过程中发挥着关键作用，同时，当它们的蛋白水解活性失调时，还与癌症的侵袭和转移密切相关，因此成为了极具潜力的药物靶点 。
然而，目前对于 TTSPs 的一些关键生化机制，比如它们如何促进病毒进入细胞，还并不清楚。其中，跨膜蛋白酶丝氨酸 2（Transmembrane Protease, Serine-2，TMPRSS2）和 TMPRSS11D 在病毒感染过程中至关重要，但它们的具体作用机制尚不明晰。而且，TTSPs 家族中的 HAT/DESC 亚家族成员，虽然彼此之间序列相似度高，却缺乏选择性抑制剂，其在人类呼吸道中的具体作用及潜在冗余性也有待探究。在这样的背景下，来自加拿大等地的研究人员展开了深入研究，相关成果发表在《Nature Communications》上。
研究人员运用了多种技术方法来开展此项研究。在蛋白表达与纯化方面，通过构建不同的蛋白表达载体，利用杆状病毒感染 Sf9 昆虫细胞来表达 TMPRSS11D 和 TMPRSS2 蛋白，并进行纯化。在结构解析上，采用 X 射线晶体学技术，解析了 TMPRSS11D 与天然及工程化激活基序的共晶体结构。同时，运用生化分析和生物物理分析方法，如荧光肽酶活性测定、抑制剂效力测定、差示扫描荧光法（Differential Scanning Fluorimetry，DSF）等，对蛋白的功能和与抑制剂的相互作用进行研究 。
研究结果如下：
- 自切割限制蛋白产量：研究发现，TMPRSS2 和 TMPRSS11D 的自切割激活会限制它们在重组宿主细胞中的过表达。通过替换 TMPRSS11D 的酶原激活基序（zymogen activation motif），构建 dasTMPRSS11D，可提高蛋白表达水平；而引入催化丝氨酸突变（S368A）的 eTMPRSS11D S368A 也能改善表达。实验表明，dasTMPRSS11D 会发生快速自切割激活，eTMPRSS11D S368A 在与活性 dasTMPRSS11D 共孵育时也能被激活，这直接证明了 TMPRSS2 和 TMPRSS11D 具有自切割激活能力 。
- 激活基序肽抑制 TMPRSS 蛋白酶：研究人员开发了体外检测 TMPRSS11D 抑制剂的方法，筛选出 Boc-QAR-AMC 作为底物。基于 TMPRSS11D 和 TMPRSS2 能有效切割自身酶原基序的特性，设计了含酮苯并噻唑（kbt）的模拟肽抑制剂 PM-1 和 PM-2。实验显示，PM-1 和 PM-2 对 TMPRSS11D 的抑制效果优于传统小分子抑制剂，而 TMPRSS2 对多种抑制剂的抑制效果较为一致 。
- 萘莫司他的作用机制：萘莫司他（nafamostat）、卡莫司他（camostat）等酯类丝氨酸蛋白酶抑制剂曾被探索用于 COVID-19 治疗。研究发现，萘莫司他能快速酰化 dasTMPRSS11D 的 S368 残基，但酰化酶复合物会迅速水解，恢复蛋白酶活性，其对 TMPRSS11D 的抑制半衰期仅 0.2 小时，远低于对 TMPRSS2 的抑制效果。DSF 实验表明，萘莫司他依赖 TMPRSS11D 的 S368 残基诱导蛋白热稳定性变化，但对 TMPRSS11D 的热稳定作用不如 TMPRSS2 。
- 活性 dasTMPRSS11D 切割 SARS-CoV-2 S 蛋白：实验证实，活性 dasTMPRSS11D 能切割重组 SARS-CoV-2 S 蛋白，将 150kDa 的蛋白条带转化为 100kDa 和 70kDa 的条带。预先用萘莫司他或 6 - 脒基 - 2 - 萘酚处理 dasTMPRSS11D，可阻断其蛋白酶活性，这为 TMPRSS11D 药物筛选后的活性化合物确认提供了功能检测方法 。
- TMPRSS11D 切割基序辅助晶体堆积：在尝试解析 TMPRSS11D 与萘莫司他的酰化酶复合物结构时，意外发现 TMPRSS11D 晶体中，切割后的酶原激活基序与相邻蛋白酶分子相互作用。研究人员成功解析了 dasTMPRSS11D 和 eTMPRSS11D S368A 的晶体结构，发现 TMPRSS11D 的酶原激活基序在晶体中呈 α- 螺旋结构，与其他 TTSPs 的 β- 链结构不同，且 SEA 结构域在晶体中未被解析 。
- TMPRSS11D S1 和 S1’影响抑制剂结合：分析 TMPRSS11D 的底物结合裂隙（S1、S1’、S2 和 S3 口袋）发现，其 S1 缺乏与 TMPRSS2 的 S1 中保守的氢键供体，这可能是萘莫司他对 TMPRSS11D 热稳定作用较弱和酰化酶复合物快速水解的原因。S1’的差异可能影响对模拟肽抑制剂 kbt 部分的识别，为开发选择性抑制剂提供了方向 。
- TMPRSS11D 和 TMPRSS2 S2 的差异与靶向性：TMPRSS11D 的 S2 包含 R230、Y264 和 H269，与其他 TTSPs 不同。研究人员设计了一系列 P2 位点修饰的模拟肽，发现 PM-3（Ac-EER-kbt）是一种高效的 TMPRSS11D 和 TMPRSS2 双抑制剂，而 PM-5（Ac-E (Orn) R-kbt）对 TMPRSS2 具有选择性抑制作用 。
- 模拟 TMPRSS11D 酶原激活和脱落：利用 AlphaFold2 预测全长 TMPRSS11D 的结构，发现其酶原激活基序的构象适合被 TMPRSS11D 切割。激活后的 TMPRSS11D 可能进一步切割 SEA 结构域附近的残基，使活性 SP 结构域从细胞表面脱落 。
研究结论和讨论部分指出，本研究揭示了 TMPRSS11D 和 TMPRSS2 能识别自身及彼此的酶原激活基序并激活，为理解 TTSPs 的酶原激活机制提供了重要依据。萘莫司他等酯类化合物可能不适用于表达 TMPRSS11D 的人类气道细胞的抗病毒治疗，而基于酶原激活基序序列的含 kbt 模拟肽则是更有效的 TMPRSS11D 抑制剂。此外，研究还为合理设计靶向 TMPRSS11D 和 TMPRSS2 的模拟肽抑制剂提供了结构基础，所采用的蛋白酶结晶策略可能适用于其他 TTSPs 研究。TTSPs 的自切割激活或许可作为判断蛋白酶驱动呼吸道病毒感染能力的指标，为未来抗病毒药物研发中选择人类蛋白酶靶点提供参考，有助于深入理解病毒致病机制，推动抗病毒药物的开发 。
