RNA转录本作为人类细胞双链断裂修复模板的机制及其在癌症基因组中的突变特征

本研究揭示了RNA转录本可直接作为双链断裂（DSB）修复模板的新机制。通过荧光和测序报告系统，研究人员发现DNA聚合酶zeta（Polζ）在RNA模板化DSB修复（RT-DSBR）中发挥关键逆转录酶作用。全基因组分析进一步发现，癌症中存在的全内含子缺失（WID）是RT-DSBR的独特特征。该研究为理解转录与基因组稳定性关联提供了新视角，对癌症突变机制和基因治疗策略具有重要启示意义。

　　

在基因组不断遭受内源性和外源性损伤的环境中，双链断裂（DSB）是最具破坏性的DNA损伤类型之一，可导致衰老、癌症和神经退行性疾病。传统观点认为DSB修复主要通过同源重组（HR）、非同源末端连接（NHEJ）和微同源介导的末端连接（MMEJ）三种途径完成，这些途径通常独立于RNA发挥作用。然而，随着研究发现78%的人类基因组存在活跃转录，DSB修复与转录活动的时空协调成为维持基因组稳定的关键问题。虽然已知RNA:DNA杂交体和邻近转录本可间接影响修复结果，但RNA能否直接作为DSB修复模板这一根本问题尚未解决。

Memorial Sloan Kettering癌症中心等机构的研究人员通过开发新型报告系统并结合全基因组分析，首次证实人类细胞可利用RNA转录本直接修复DSB，并鉴定出DNA聚合酶zeta（Polζ）的核心作用。研究还发现癌症基因组中存在的全内含子缺失（WID）是RNA模板化修复的独特特征。这项发表于《Nature Communications》的研究，为理解转录与基因组稳定性关系提供了新范式。

研究采用多学科技术方法：1）BFP-GFP荧光报告系统和AAVS1位点测序分析（AAVS1-seq）定量RNA模板化修复效率；2）CRISPR/Cas9全基因组筛选鉴定RT-DSBR调控因子；3）siRNA敲除和药理学抑制验证关键基因功能；4）MSK-IMPACT和PCAWG癌症基因组数据库分析WID特征；5）患者肿瘤样本PCR验证内含子缺失事件。

人类细胞利用RNA模板修复DSB
通过设计含核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸 donor，研究团队在BFP-GFP报告系统中观察到显著修复效率（25% GFP⁺细胞），AAVS1-seq检测进一步证实RNA序列可被精确复制到断裂位点。竞争实验显示RNA模板修复（RT-DSBR）与单链模板修复（SSTR）存在通路竞争。

RT-DSBR独立于LINE-1和Polθ
尽管LINE-1逆转录酶和Polθ曾被推测参与RNA模板化修复，但HIV逆转录酶抑制剂（AZT/3TC）处理和POLQ敲除实验表明，这两种机制在人类细胞RT-DSBR中均非必需。值得注意的是，Polθ缺失虽降低MMEJ特征，但不影响RT-DSBR效率。

CRISPR筛选揭示Polζ的关键作用
针对1,285个DNA损伤应答基因的筛选发现，53BP1缺失使RT-DSBR效率提高3倍，而HELQ等HR因子促进修复。在14种DNA聚合酶中，Polζ亚基REV3L和POLD1在RNA模板修复中特异性富集。后续验证实验显示，REV3L敲除使AAVS1位点的GAT插入特征减少50%，且不影响DNA模板修复，证实其逆转录酶特异性。

内源转录本指导修复导致内含子缺失
当CRISPR/Cas9在CALR和GNAS基因内含子引入DSB时，利用剪接mRNA作为模板的修复导致精确的内含子缺失（WID）。这种效应在转录沉默基因IL3中未被观察到，且REV3L敲除显著降低WID频率，证实Polζ介导的RT-DSBR依赖转录活性。

癌症基因组中的WID特征
对64,544例MSK-IMPACT肿瘤样本的分析发现113个WID事件，远超随机预期（p<0.0001）。约50%的WID呈连续分布，如GNAS基因中观察到5个连续内含子缺失。患者样本PCR验证（如HLA-B基因）确认了这些缺失的精确性。数学模拟表明，自然发生连续WID的概率极低（最大4例/10,000次模拟），强烈支持剪接mRNA指导修复的假说。

这项研究确立了RT-DSBR作为人类细胞DSB修复的新途径，其核心在于Polζ的逆转录酶活性和转录本的空间可及性。从机制角度看，该发现扩展了对DNA聚合酶功能多样性的认知——传统认为Polζ主要参与跨损伤合成（TLS），现证明其能介导RNA→DNA的遗传信息转换。从病理角度，WID作为"分子疤痕"为追溯癌症发展中的非常规修复事件提供了新标记。

研究还引发一系列有待探索的问题：Polζ如何被招募到断裂位点？转录抑制（如ATM激活）如何影响RT-DSBR效率？在神经元等非分裂细胞中，该通路是否提供比易错NHEJ更安全的修复选择？这些问题的解答将深化对基因组稳定性维持机制的理解，并为开发靶向RNA-DNA互作的抗癌策略奠定基础。