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为评估纳米孔（Nanopore）测序在临床细菌鉴定中的效用，瑞典基因组医学中心协调多实验室开展 16S rRNA 测序研究。研究发现其潜力良好，但存在优化空间。该研究为临床微生物实验室应用 Nanopore 测序提供依据，助力提升精准诊断水平。
在细菌鉴定领域，传统的检测方法面临诸多挑战。比如，常规的桑格测序（Sanger sequencing）通常只能检测单一病原体，难以满足复杂感染的诊断需求。而二代测序技术，像 Illumina 平台虽读长质量高，但只能覆盖 16S rRNA 基因部分可变区。在这样的背景下，纳米孔（Nanopore）测序技术因其能实现长读长测序且可实时获取快速结果，成为极具潜力的新选择。然而，将其应用于临床时，仍存在缺乏标准化解读协议等问题，尤其是在多微生物感染的情况下，难以区分真正的感染病原体和背景菌群。
为了解决这些问题，瑞典基因组医学中心（Genomic Medicine Sweden）组织开展了一项全国多中心研究。众多研究人员参与其中，旨在评估基于 Nanopore 技术的 16S rRNA 测序作为临床诊断方法的性能。该研究成果发表在《European Journal of Clinical Microbiology 》上，为临床微生物诊断带来了新的思路和方向。
研究人员采用了一系列关键技术方法。他们构建了包含多种细菌菌株的模拟样本（GMS - mock）和来自 QCMD 的外部质量评估（EQA）样本。各实验室独立提取 DNA，主要使用 16S Barcoding Kit 24 V14 构建文库并测序。数据分析时，运用了商业的 1928 - 16S 和基于 EMU 分类工具的开源 GMS - 16S 两种生物信息学分析流程。
在测序性能方面，20 个实验室中有 17 个成功完成样本测序与分析。部分实验室因使用含醋酸钠的洗脱缓冲液，在文库构建时出现兼容性问题，导致读数减少。同时，样本运输中虽用干冰保存，但部分样本解冻，不过这对单次运行的总读数影响不大。QCMD 样本和 GMS 样本的平均读长分别为 1567 ± 63 bp 和 1484 ± 50 bp，平均读质量分别为 16.5 ± 1.2 和 17.7 ± 1.8 。
对于 16S rRNA 细菌鉴定，在单微生物样本中，所有实验室能识别高细菌载量的 QCMD 样本中的正确菌种，但对定制的 GMS 样本检测效果较差。大多数实验室能检测到的最低细菌浓度为 190 CFU/mL，像肺炎链球菌（S. pneumoniae）在 0.03 CFU/mL 和偶然分枝杆菌（M. fortuitum）在 200 CFU/mL 时，多数实验室难以检测到。难裂解的细菌如痤疮丙酸杆菌（C. acnes）检测水平也较低。在多微生物样本中，不同样本检测情况各异。如样本 G11 包含表皮葡萄球菌（S. epidermidis ）和金黄色葡萄球菌（S. aureus），各实验室检测结果差异较大；样本 G1 中大肠杆菌（E. coli）检测效果不佳。
在两种生物信息学流程的评估中，1928 - 16S 识别的菌种数量较多，但 GMS - 16S 在物种水平分类上更准确，能有效区分链球菌属和葡萄球菌属中密切相关的分类群，以及肠杆菌科（Enterobacteriaceae）的成员。
此外，研究还对污染情况进行了检测。发现高细菌载量样本的污染物种较少，低生物量样本和阴性对照样本的污染物种较多。最常检测到的污染物是痤疮丙酸杆菌。
研究结论表明，Nanopore 测序在临床环境中对细菌鉴定展现出良好的潜力，但仍需进一步优化实验方案，以提高对更多种类细菌的检测能力。该研究凸显了在临床微生物实验室实施 Nanopore 测序的可行性，有望推动全国精准诊断水平的提升。在讨论部分，研究人员指出实验存在的一些局限性，如缺乏重复实验、实验室间存在差异等。同时强调了优化提取方法、引物兼容性和生物信息学工具的重要性，未来研究可针对这些方面展开，以更好地发挥 Nanopore 测序在临床诊断中的作用。
