CRISPR/Cas9靶向敲除Kell蛋白揭示宿主导向型抗疟新策略：锌内肽酶抑制剂Thiorphan的不可抗拒机制

疟原虫耐药性升级迫使抗疟策略转向宿主靶点。印度科研团队通过CRISPR/Cas9敲除红系祖细胞BEL-A的Kell基因，证实该锌内肽酶是疟原虫入侵红细胞的关键共受体。研究发现临床药物Thiorphan通过特异性抑制Kell蛋白酶活性，在纳摩尔浓度即可阻断恶性疟原虫(Pf)入侵，其前药Racecadotril在动物模型中展现显著抗疟效果。该研究为宿主导向型抗疟疗法提供了新靶点，发表于《Communications Biology》。

　　

疟疾防治正面临严峻挑战。随着疟原虫对青蒿素等一线药物产生耐药性，全球每年仍有数亿人感染这种由按蚊传播的寄生虫病。传统抗疟策略主要靶向疟原虫自身代谢途径，但狡猾的病原体通过基因突变不断逃逸药物作用。在这种背景下，科学家开始将目光转向宿主因子——那些被疟原虫"劫持"来完成生命周期的宿主蛋白质。红细胞表面蛋白尤其引人注目，因为疟原虫必须在侵入红细胞后才能致病。然而，关于宿主蛋白酶如何调控疟原虫入侵的具体机制仍存在重大知识空白。

印度科研团队在《Communications Biology》发表的研究揭示了Kell血型抗原这一宿主蛋白的全新抗疟价值。Kell是红细胞表面第三大免疫原性蛋白，属于锌依赖性内肽酶家族，能切割大内皮素-3。研究人员发现，恶性疟原虫(P. falciparum)竟巧妙地"征用"了Kell的蛋白酶活性来促进自身入侵。为验证这一发现，团队采用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在红系祖细胞BEL-A中成功敲除Kell基因，获得Kell-null红细胞模型。这些改造后的红细胞对疟原虫入侵的抵抗能力显著提升，入侵效率降低约60%。更令人振奋的是，锌内肽酶抑制剂Thiorphan能特异性阻断Kell的蛋白酶活性，在体外实验中仅需纳摩尔浓度即可有效抑制疟原虫入侵。动物实验进一步证实，Thiorphan及其前药Racecadotril能显著降低感染伯氏疟原虫(P. berghei)小鼠的寄生虫血症并提高存活率。

研究团队运用了多项关键技术：1) CRISPR/Cas9基因编辑构建Kell敲除的BEL-A红系祖细胞系；2) 流式细胞术和免疫荧光验证蛋白表达；3) 锌亲和层析纯化Kell蛋白；4) 微尺度热泳动(MST)分析药物-蛋白相互作用；5) 细胞热转移实验(CETSA)确认靶点结合；6) 体外和体内疟原虫入侵抑制实验；7) 来自印度特里普拉邦疟疾流行区的临床样本分析。

研究结果部分，"CRISPR-Cas9 mediated Kell knockout in BEL-A cell line"显示：通过靶向Kell基因外显子1的sgRNA，团队获得两个Kell敲除克隆(23和31号)。测序证实克隆存在4个碱基(AAGG)缺失，免疫印迹和酶活实验显示Kell表达和活性显著降低。重要的是，其他红细胞表面受体如带3蛋白(Band 3)、血型糖蛋白(Glycophorin A/B)和细胞骨架蛋白血影蛋白(Spectrin)、锚蛋白(Ankyrin)的表达未受影响，证明基因编辑的特异性。

"Invasion and metalloprotease activity of Kellnull BEL-A derived reticulocyte"部分揭示：与野生型相比，Kell-null网织红细胞的疟原虫入侵效率降低60%。酶活实验证实Kell敲除细胞中锌内肽酶活性显著减弱。当加入Thiorphan后，野生型红细胞出现50%入侵抑制，而Kell-null细胞未见额外抑制，证明药物作用具有Kell依赖性。

"Thiorphan, an inhibitor of Kell's metalloprotease activity"部分证实：Thiorphan与Kell的结合解离常数(K_d)为33μM，结合能为-5.83 kcal/mol。体外实验中，Thiorphan对敏感株Pf3D7和耐药株PfRKL-9的半数抑制浓度(IC₅₀)分别为621.6 nM和655.5 nM。红细胞预孵育实验证明药物通过宿主Kell而非直接作用于寄生虫起效。

"In vivo antimalarial efficacy of thiorphan and its prodrug racecadotril"显示：Thiorphan(2.5 mg/kg)使小鼠寄生虫血症降低5倍；其前药Racecadotril(125 mg/kg)口服给药使寄生虫负荷减少50-60%，且无显著毒副作用。值得注意的是，小鼠红细胞对Thiorphan更敏感(IC₅₀更低)，可能与红细胞大小差异有关。

"Ex vivo antimalarial efficacy of thiorphan"有重要发现：来自印度特里普拉邦疟疾流行区的红细胞Kell表达量显著低于非流行区(德里)，且Kell低表达个体的红细胞对Thiorphan更敏感。酶活分析显示流行区样本的Kell蛋白酶活性降低，与Thiorphan疗效呈正相关(Pearson系数0.4114)。

讨论部分指出，这是首次揭示Kell作为疟原虫入侵的关键宿主因子。虽然Kell敲除不能完全阻断入侵(提示疟原虫存在替代途径)，但该发现为宿主导向疗法提供了新思路。特别值得注意的是，临床已批准的抗腹泻药Racecadotril(Thiorphan前药)展现出良好抗疟潜力，有望加速临床转化。研究还揭示了人群水平的适应性进化——疟疾流行区居民红细胞Kell表达降低，可能是长期自然选择的结果。

这项研究开辟了抗疟新途径：通过靶向宿主红细胞不可或缺的Kell蛋白酶，可规避疟原虫的耐药机制。将已批准药物Racecadotril重新用于抗疟的"老药新用"策略，尤其适合资源有限的疟疾流行区。未来研究需要优化给药方案，探索联合疗法，并利用Kell敲除动物模型进一步验证靶点安全性。该成果为抗击耐药疟疾提供了不可多得的宿主靶点和新武器。