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在糖苷水解酶（GH）催化反应中，水分子动力学在纳米尺度尚不明晰。研究人员以 HvExoI 为对象，探究非亲核谷氨酸 E220 对水分子网络的作用。结果发现 E220A 突变体催化效率大幅降低，且水分子网络紊乱。该研究为水解酶催化机制提供蓝图，助力生物工程发展。
在生命的奇妙进程中，水扮演着至关重要的角色，它不仅是生命的溶剂，还深度参与众多化学反应，在酶催化过程里，水的身影也无处不在。在糖苷水解酶（Glycoside hydrolases，GH）的世界里，它们肩负着通过转移水分子来打破碳水化合物糖苷键的重任，然而，在微观的纳米尺度下，水分子的动态变化却如同隐藏在迷雾之中，神秘莫测。这一未知如同拦路虎，阻碍着我们对酶催化机制的深入理解，也限制了相关生物技术的发展。
为了揭开这层神秘的面纱，来自澳大利亚阿德莱德大学（University of Adelaide）、西班牙巴塞罗那自治大学（Universitat Autònoma de Barcelona）等机构的研究人员踏上了探索之旅。他们聚焦于一种属于 GH3 家族的 β-D - 葡聚糖葡糖水解酶（β-D-glucan glucohydrolase）HvExoI，重点研究其中非亲核谷氨酸 E220 对水分子网络的影响。研究发现，E220A 突变体虽然保留了底物多特异性，但与野生型相比，其催化效率大幅降低。通过高分辨率结构分析以及计算模型研究，他们揭示了野生型中水分子形成了协调的网络，而突变体中这一网络变得紊乱。此外，祖先序列重建分析表明，参与水分子网络的残基在进化过程中高度保守。这一研究成果发表在《Communications Biology》上，为理解水解酶的催化机制提供了全新的视角，也为生物工程领域创造可持续的生物经济提供了重要的理论基础 。
研究人员在探索过程中运用了多种关键技术方法。首先是定点突变技术，构建 E220A 突变体，为研究特定氨基酸残基的功能提供模型。其次，通过 X 射线晶体学技术解析野生型和突变体的高分辨率结构，直观展现蛋白质的三维构象以及水分子的分布情况。再者，利用经典分子动力学（cMD）模拟，从动态角度研究蛋白质与水分子的相互作用和运动轨迹。最后，借助祖先序列重建（ASR）技术，追溯 GH3 家族酶的进化历程，探寻水分子网络相关特征的演化规律。
研究结果主要包含以下几个方面：
- 突变体的动力学和结合特性改变：通过测量野生型（WT）和 E220A 突变体的水解活性、计算动力学参数，发现 E220A 突变主要影响 kcat参数，导致其对多种底物的催化效率显著下降，与底物类似物和抑制剂的结合能力也发生改变1。
- 晶体结构揭示的水分子网络差异：解析 E220A 突变体的晶体结构并与 WT 对比，发现两者在水分子数量、配位模式以及与底物结合时的相互作用存在明显差异，这些差异影响了活性位点的水分子网络分布2。
- 计算模型展示的分子动态变化：cMD 模拟构建 WT 和 E220A 共价复合物模型，分析发现突变导致残基的柔性、氢键相互作用、侧链二面角分布改变，影响了水分子的分布、频率和催化活性，突变体中催化水分子数量减少且分布紊乱3。
- 祖先序列重建分析的进化特征：采用 FireProtASR 进行 ASR 分析，发现植物 GH3 亚类在进化过程中保留了独特的水分子配位残基特征，参与水分子网络的关键残基在植物 GH3 及其祖先节点中高度保守4。
在讨论部分，研究人员深入剖析了研究成果的意义。HvExoI 采用底物 - 产物辅助的连续催化机制，E220 在其中与 E491 协同配位水分子，对催化起着关键作用。通过对 E220A 突变体的研究，明确了该残基对维持水分子网络和催化效率的重要性。研究中运用的 cMD 模拟等技术，有效揭示了水分子在酶催化过程中的动态变化规律，为理解水解酶的催化机制提供了详细信息。此外，ASR 分析揭示了进化过程中活性位点残基的保守性，为研究酶的进化和功能优化提供了线索。
这项研究综合多种技术手段，深入探究了糖苷外切水解酶中水分子网络与催化效率的关系，不仅加深了我们对酶催化机制的理解，还为生物工程领域优化酶的性能、开发更高效的生物催化剂提供了理论指导，在生物技术产业和生物经济发展中具有广阔的应用前景。
