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为解决小细胞外囊泡（sEVs）分离方法的难题，研究人员开展 sEVs 分离新方法的研究。通过对比多种方法，发现 PEG 沉淀结合超滤（CPF）法能高效分离高纯度、高产量 sEVs，且适用于多组学分析，推动了 sEVs 在科研和临床的应用。
在生命科学和医学研究领域，小细胞外囊泡（small extracellular vesicles，sEVs）犹如一颗新星，备受关注。sEVs 是细胞释放的一类纳米级囊泡，直径在 30 - 200 纳米之间，它能携带蛋白质、核酸等生物分子，在细胞间通讯中发挥着关键作用，就像细胞之间传递信息的 “小信使”。由于 sEVs 可反映细胞的病理生理状态，在疾病诊断、治疗和药物递送等方面展现出巨大的潜力，因此成为了科研人员竞相探索的热门领域。
然而，sEVs 的研究之路并非一帆风顺。目前，科研人员在研究 sEVs 时面临着诸多挑战，其中最棘手的问题之一便是缺乏简单且经济高效的 sEVs 分离方法。常用的分离方法，如超速离心法（ultra - centrifugation，UC）、尺寸排阻色谱法（size - exclusion chromatography，SEC）和免疫亲和捕获法等，都存在各自的局限性。超速离心法虽能分离出 sEVs，但耗时久，还需要专门的设备和专业技术人员操作；尺寸排阻色谱法在分离复杂生物流体中的 sEVs 时效果欠佳；免疫亲和捕获法虽特异性强，但成本高昂。此外，对分离得到的 sEVs 进行准确表征也困难重重，现有的表征方法在临床应用中难以全面实施。正因如此，开发一种能满足研究和临床需求，可获得高纯度、高产量 sEVs 的简便方法迫在眉睫。
为了攻克这些难题，来自印度全印医学科学研究所（All India Institute of Medical Sciences）等多个机构的研究人员联合开展了一项极具意义的研究。他们致力于探索一种创新的 sEVs 分离方法，并将其与传统方法进行对比，旨在找到更优的解决方案。经过一系列严谨的实验和深入的分析，研究人员发现，采用聚乙二醇（PEG）沉淀结合超滤（CPF）的鸡尾酒策略效果显著。这种方法不仅操作相对简便，对实验室条件要求较低，而且分离得到的 sEVs 纯度高、产量也令人满意。更为重要的是，CPF 法与多组学分析兼容，这为 sEVs 在基础研究和临床诊断等领域的广泛应用奠定了坚实的基础。该研究成果发表在《Scientific Reports》上，为 sEVs 研究领域注入了新的活力。
在这项研究中，研究人员运用了多种关键技术方法。首先，在样本处理上，从健康个体采集唾液、外周血，培养 SH - SY5Y 神经母细胞瘤细胞获取细胞培养基，为后续实验提供样本来源。然后，采用 PEG 沉淀、PEG 沉淀结合超滤、超速离心和尺寸排阻色谱柱这四种方法分离 sEVs。在 sEVs 的表征方面，利用透射电子显微镜（TEM）观察其超微结构形态，纳米颗粒跟踪分析（NTA）测定浓度和粒径分布，蛋白质定量（BCA）法和免疫印迹法检测 sEVs 蛋白标记物表达情况。最后，对血浆来源的 sEVs 进行质谱分析、小 RNA 测序和脂质组学分析，评估 CPF 法在下游多组学研究中的适用性。
下面让我们详细了解一下研究结果。
- sEVs 的超微结构形态：通过透射电子显微镜观察发现，从细胞培养基、血浆和唾液中分离出的 sEVs 呈圆形囊泡结构，直径在 30 - 150 纳米之间，部分 sEVs 含有内部囊泡，且都具有脂质双分子层膜。对比不同方法，CPF 法分离得到的 sEVs 纯度最高，几乎没有非囊泡颗粒或杂质。此外，激光共聚焦显微镜实验显示，CPF 法分离的 sEVs 中 CD9（一种 sEVs 表面标记物）表达特异性更强，进一步证明了其纯度优势。
- sEVs 的定量分析：利用纳米颗粒跟踪分析（NTA）对 sEVs 进行浓度和粒径分布测定。结果表明，CP 法分离得到的 sEVs 浓度最高，而 UC 法最低，CPF 法和 SEC 法的浓度介于两者之间。在粒径方面，不同样本中，UC 和 SEC 法分离出的 sEVs 粒径较大，CP 法分离出的最小，且 SEC 法分离得到的 sEVs 粒径分布变化最大。研究人员还计算了颗粒与蛋白质的比率，发现 UC 和 SEC 法的比率较高，CPF 法次之，CP 法最低，这意味着从该比率评估纯度时，UC 和 SEC 法纯度较高，CPF 法也有不错的表现。
- sEVs 蛋白标记物的表达：免疫印迹分析显示，从唾液、血浆和细胞培养基中分离出的 sEVs 均表达预期的 sEVs 相关蛋白，如 CD63、CD9、Flotillin - 1 和 TSG101 等。在唾液和血浆来源的 sEVs 中，CPF 法分离得到的 sEVs 中 CD63 蛋白表达量最高，表明其 sEVs 产量最高，CP 法次之。在细胞培养基来源的 sEVs 中，CP 和 CPF 法分离得到的 sEVs 中 CD9 表达较高，TSG101 蛋白表达在各方法间无明显差异。此外，SEC 法分离的 sEVs 中，CD9 表达在不同分馏物中呈现特定变化趋势，且 CPF 法相较于 CP 法，Apolipoprotein B（ApoB）表达降低，说明 CPF 法能减少血浆蛋白污染，进一步证明其分离 sEVs 的优势。
- 血浆来源 sEVs 的多组学评估：对血浆来源的 sEVs 进行多组学分析，以评估 CPF 法的适用性。质谱分析中，总离子色谱图显示肽峰分离良好，表明 CPF 法与质谱分析兼容，样本质量高。在小 RNA 测序分析中，选择 miR - 16 - 5p 作为检测指标，熔解曲线分析显示其引物特异性好，且原始 Cq 值表明从血浆来源 sEVs 中分离的 RNA 质量较高。脂质组学分析中，总离子色谱图与已有研究相符，证明 CPF 法可用于全面分析 sEVs 脂质含量。
综合研究结果和讨论部分，这项研究具有重要意义。研究人员提出的 PEG 沉淀结合超滤（CPF）的鸡尾酒策略，为 sEVs 的分离提供了一种高效、简便且经济的方法。该方法在分离高纯度、高产量 sEVs 方面表现出色，且能很好地适用于下游多组学分析，极大地推动了 sEVs 在基础研究和临床诊断中的应用。这不仅有助于科研人员更深入地了解 sEVs 的生物学特性和功能，还为开发基于 sEVs 的新型诊断和治疗方法提供了有力支持，有望在未来的医学领域发挥重要作用，为人类健康事业做出贡献。
